打破衍射极限：从阿贝成像理论到超分辨荧光显微
2026 年 10 月
1 导读
用光学显微镜看一个细胞，能看清多小的东西？直觉的回答是“放大倍数越大越清楚”。19 世纪 70 年代，德国耶拿的物理学家阿贝（Ernst Abbe）指出这个直觉是错的：显微镜的分辨本领由光的波长和物镜能收集的光锥角度决定，放大倍数再大也只是把模糊的像放大。对可见光，这个极限约为 200 nm。一百多年里，这被看作光学显微镜不可逾越的“衍射极限”。
20 世纪 90 年代以来，物理学家找到了绕过它的办法。这些办法并没有推翻阿贝的结论，而是利用了阿贝理论成立的前提之一：成像过程是线性的，即像中每一点的亮度与物上各点的亮度成正比。只要让荧光分子的发光对照明光强度作非线性响应（例如饱和），或者让分子随机地、一个一个地亮起来，就能在远场光学显微镜中看到几十纳米甚至几纳米的结构。本讲沿着这条思路展开：先弄清衍射极限从哪里来、为什么在线性成像中不可逾越，再看三类超分辨方法分别怎样绕过它。
1873 年，阿贝在《显微解剖学文献》上发表长文《显微镜理论与显微知觉》[1]。他指出：如果结构细到连第一束衍射光都不能与未衍射的光同时进入物镜，任何显微镜都无法把它分辨出来。文中用文字给出了结论：正入射照明时，可分辨的最小间距等于波长除以物镜半孔径角的正弦；最倾斜的照明时恰好减半；因此分辨极限“永远不会明显超过蓝光波长的一半”（原文第 19 节，第 455–456 页）。1873 年的论文里并没有公式。1881 年，阿贝在英国皇家显微学会杂志上明确定义了“数值孔径”\(n\sin\alpha\)[2]，用它刻画浸没物镜收集光锥的大小。后人把阿贝的结论写成 \(d=\lambda/(2n\sin\alpha)\)，耶拿的阿贝纪念碑上刻的就是这个公式（图 1）。
另一条线索来自天文望远镜。1835 年，艾里（George Airy）算出圆形透镜所成的点像不是一个点，而是一个中央亮斑外围绕一圈圈暗环和亮环的图样（今称 Airy 斑）[3]。艾里的数值表给出：中央亮斑在 \(v=1.616\) 处降到一半，第一暗环在 \(v=3.832\) 处（\(v\) 的定义见式 (3.11)）。1879 年，瑞利（Lord Rayleigh）在研究光谱仪的分辨本领时，讨论了两条谱线的像：当一条的中央极大与另一条的第一个零点重合时，两像之间中点的亮度是峰值的 81%，他认为这大约是“刚能看出分开”的界限[4]。把同一约定用到圆孔的 Airy 斑上，就是今天常说的瑞利判据，对显微镜给出最小可分辨距离 \(0.61\lambda/\mathrm{NA}\)（第 4.5 节）。
2014 年诺贝尔化学奖授予 Eric Betzig、Stefan W. Hell 与 William E. Moerner，以表彰他们“发展了超分辨荧光显微技术”[5]。
受激发射损耗（STED）显微：Hell 与 Wichmann 于 1994 年提出[6]：用一束耗尽光把焦斑外围的激发分子“强迫”退激发，只留下中心极小区域发荧光。1999 年 Klar 与 Hell 用一束偏置的耗尽光，在一个横向方向上把光斑从 150 nm 压到 106 nm[7]；2000 年用相位板产生中心为零的耗尽光，把轴向光斑从 490 nm 压到 97 nm，横向光斑同时缩小约一半[8]；2009 年在金刚石色心上达到 5.8 nm[9]。
单分子定位显微：1989 年 Moerner 与 Kador 首次在固体中用光学方法探测到单个分子的吸收[10]，1990 年 Orrit 与 Bernard 探测到单分子荧光[11]；1997 年 Moerner 等人发现绿色荧光蛋白的突变体可以被光“开关”[12]。2006 年，Betzig 等人的 PALM（光激活定位显微）[13]、Hess 等人的 FPALM[14]、庄小威（Xiaowei Zhuang）小组的 STORM（随机光学重建显微）[15] 几乎同时发表：每次只让稀疏的少数分子发光，逐个精确定位，再把成千上万帧叠加成图像。
结构光照明显微（SIM）：用条纹状照明把样品中超出截止频率的细节“搬”进物镜的通带。Heintzmann 与 Cremer[16]、Gustafsson[17] 分别在 1999、2000 年发表，线性 SIM 把分辨率提高到约 2 倍；Gustafsson 2005 年利用荧光饱和实现了非线性 SIM[18]。
2017 年，Hell 小组把“激发光的零点”与“单分子开关”结合，提出 MINFLUX：所需光子数比相机质心定位少约 22 倍，定位精度达到约 1 nm，分辨出相距 6 nm 的分子[19]；2020 年在细胞中实现了 1–3 nm 的分辨率[20]。
学习目标
学完本讲，你应当能够：
用“空间频率”的语言描述光的衍射：把夫琅禾费衍射理解为孔径函数的傅里叶变换，算出单缝、光栅、圆孔的衍射图样，说明 Airy 斑第一暗环 \(1.22\lambda/D\) 的来历；
由阿贝成像理论推出最小可分辨周期 \(\lambda/\mathrm{NA}\)（正入射）与 \(\lambda/(2\mathrm{NA})\)（斜照明），理解成像系统是空间频率的低通滤波器，区分相干与非相干（荧光）成像的截止频率；
说明为什么在线性成像中增大光强、改进算法都不能越过截止频率，并指出三条出路：非线性响应、关于样品的先验知识、照明对频率的搬移；
由速率方程得到荧光饱和与受激辐射耗尽的规律，推出 STED 有效点扩散函数宽度 \(w\approx w_0/\sqrt{1+\beta I_{\max}/I_s}\) 并估算所需功率；
由光子统计推出单分子定位精度 \(\sigma_{\mathrm{loc}}\approx\sqrt{(s^2+a^2/12)/N}\)，理解标记密度对分辨率的限制；
由三角函数积化和差理解莫尔条纹与结构光照明的频率搬移，推出线性 SIM 的 2 倍上限；
处理单分子反复定位的数据：线性化、拟合、不确定度与系统误差分析。
光学：光的波动性、惠更斯原理、杨氏双缝干涉、单缝与光栅衍射的初步结论、折射定律、薄透镜成像；
近代物理：光子能量 \(h\nu\)、原子能级与跃迁；
数学：复数与欧拉公式 \(\ee^{\ii\theta}=\cos\theta+\ii\sin\theta\)、三角函数积化和差、泰勒展开、定积分、极坐标下的面积分、平均值与方差的初步概念。
本讲新引入的工具（复振幅、空间频率、傅里叶变换与卷积、贝塞尔函数、传递函数、速率方程、随机变量的方差、采样定理、最小二乘）都在首次使用前给出定义与推导。
建议学时
共 2 学时（约 90 分钟）：前置模块（波与傅里叶分析）20 分钟；阿贝理论与衍射极限 20 分钟；荧光饱和与 STED 20 分钟；单分子定位 15 分钟；结构光照明 15 分钟。例题与实验题供课后练习，附录供深入阅读。
推导路线
惠更斯–菲涅耳原理 \(\Rightarrow\)（远场近似）衍射 = 傅里叶变换 \(\Rightarrow\)（阿贝）物镜孔径截掉高空间频率，成像是低通滤波 \(\Rightarrow\) 线性成像下截止频率外的信息丢失 \(\Rightarrow\) 三条出路：（1）荧光饱和的非线性 \(\Rightarrow\) STED；（2）“样品是一个点”的先验 + 光子统计 \(\Rightarrow\) 单分子定位；（3）照明与样品频率相乘 \(\Rightarrow\) 频率搬移 \(\Rightarrow\) SIM。
2 名词与符号
几个容易混淆的说法：
分辨率与分辨本领：本讲统一指“能区分的最小间距”，数值越小越好；
点扩散函数（point spread function，PSF）：一个理想点光源经过成像系统后得到的像；
定位精度与分辨率：前者是“一个孤立分子的位置能测准到多少”，后者是“两个靠近的结构能否被区分”，两者不是一回事（第 7.5 节）；
本讲的“荧光”都指分子吸收一个光子后，经过纳秒量级的时间自发地发出一个波长较长的光子；分子之间发光互不相干。
| 符号 | 含义 | 单位 |
|---|---|---|
| \(\lambda\) | 真空中的波长（介质中波长为 \(\lambda/n\)） | nm |
| \(n\), \(\theta\) | 折射率；光线与光轴的夹角 | 1, rad |
| \(\alpha\), \(\mathrm{NA}\) | 物镜收光锥半角；数值孔径 \(\mathrm{NA}=n\sin\alpha\) | rad, 1 |
| \(U\) | 光场的复振幅（第 3.1 节） | 任意 |
| \(I\) | 光强（单位面积功率），\(I\propto\abs{U}^2\) | \(\mathrm{W/m^2}\) |
| \(f_x,f_y\); \(\vect f\) | 空间频率（单位长度内的周期数）；空间频率矢量 | \(\mu\mathrm{m}^{-1}\) |
| \(\tilde g(f)\) | 函数 \(g(x)\) 的傅里叶变换（式 (3.7)） | |
| \(d\) | 光栅（周期性结构）的周期 | nm |
| \(\ell\), \(D\); \(N_{\mathrm s}\) | 单缝宽度；圆孔直径；光栅缝数 | m; 1 |
| \(F_1,F_2\) | 物镜、筒镜的焦距 | m |
| \(T(x)\), \(c_m\) | 物的振幅透过率；其第 \(m\) 个傅里叶系数 | 1 |
| \(h(\vect r)\), \(H(\vect r)\) | 振幅点扩散函数；强度点扩散函数 \(H=\abs{h}^2\) | |
| \(P(\vect f)\) | 光瞳函数（相干传递函数） | 1 |
| \(\mathrm{OTF}(\vect f)\) | 光学传递函数（非相干） | 1 |
| \(f_c\) | 非相干成像截止频率 \(2\mathrm{NA}/\lambda\) | \(\mu\mathrm{m}^{-1}\) |
| \(v\) | 无量纲径向坐标 \(v=2\pi\mathrm{NA}\,r/\lambda\) | 1 |
| \(J_0,J_1\) | 第一类贝塞尔函数（附录 A） | 1 |
| \(w_0\), \(w\) | 衍射极限光斑与 STED 有效光斑的半高全宽 | nm |
| \(\tau\), \(\tau_p\) | 荧光寿命；耗尽光脉冲宽度 | ns |
| \(\sigma_{\mathrm a}\), \(\sigma_{\mathrm{se}}\) | 吸收截面；受激辐射截面 | \(\mathrm{cm^2}\) |
| \(I_s\), \(\zeta\) | 饱和光强（式 (5.6)、(5.7)）；\(\zeta=I_{\max}/I_s\) | \(\mathrm{W/cm^2}\), 1 |
| \(\eta\) | 受耗尽光照射后分子仍能发荧光的概率 | 1 |
| \(r_0\), \(\beta\) | 环形光中心抛物线的特征半径；STED 宽度公式中的系数 | nm, 1 |
| \(s\) | 用高斯近似的单分子像（PSF）的标准差 | nm |
| \(N\), \(\bar N\) | 一次定位所用的光子数；其平均值 | 1 |
| \(a\), \(b^2\) | 相机像素边长（折算到样品面）；每像素背景计数的方差 | nm, 1 |
| \(Q\) | 实验题中 \(\sigma^2\bar N\)（式 (10.1)） | \(\mathrm{nm^2}\) |
| \(L\), \(\gamma\) | MINFLUX 两个零点的间距；光子数比例 | nm, 1 |
| \(\sigma_{\mathrm{loc}}\) | 单分子定位精度（定位误差的标准差） | nm |
| \(\vect f_0\), \(\vect f_s\) | 照明条纹、样品条纹的空间频率矢量 | \(\mu\mathrm{m}^{-1}\) |
| \(\Lambda\), \(\mu\), \(\phi\) | 照明条纹的周期、调制度、相位 | nm, 1, rad |
| \(\mathcal E\); \(\tilde B_0,\tilde B_\pm\) | SIM 中的发光强度；三个频带 | |
| \(\kappa\), \(e_n\) | 脉冲饱和参数 \(\sigma_{\mathrm a}J_{\mathrm p}/h\nu\)；第 \(n\) 次谐波系数 | 1 |
| \(f_{\mathrm{rep}}\) | 脉冲重复频率 | Hz |
| \(\avg{X}\), \(\operatorname{Var}X\) | 随机变量 \(X\) 的期望与方差（第 7.1 节） |
3 前置模块：波、空间频率与衍射
3.1 复振幅、平面波与空间频率
单色光的电场分量随时间作简谐变化，可写成 \(E(\vect r,t)=A(\vect r)\cos[\omega t-\phi(\vect r)]\)。把振幅与相位合成一个复数 \[\tag{3.1} U(\vect r)=A(\vect r)\,\ee^{\ii\phi(\vect r)},\qquad E(\vect r,t)=\Re\!\left[U(\vect r)\,\ee^{-\ii\omega t}\right],\] 称为复振幅。两列同频光叠加时，电场相加等价于复振幅相加（取实部与相加可以交换次序）。探测器（眼睛、相机）只响应时间平均能流，即光强 \[I=\overline{E^2}\,(\text{乘以常数}) \propto \tfrac12A^2=\tfrac12\abs{U}^2 .\] 本讲只关心相对光强，写成 \(I=\abs{U}^2\)。
同一光源分出的两束光，相位差固定，叠加后 \(I=\abs{U_1+U_2}^2=\abs{U_1}^2+\abs{U_2}^2+2\Re(U_1U_2^*)\)，最后一项是干涉项。两个独立发光的荧光分子，相位差在纳秒内随机变化，干涉项的时间平均为零，于是 \(I=I_1+I_2\)：非相干叠加。这个区别在第 4.4 节决定了荧光显微镜的截止频率。
在折射率为 \(n\) 的均匀介质中，沿单位矢量 \(\uvec k\) 传播的平面波的复振幅为 \(U=U_0\ee^{\ii\vect k\cdot\vect r}\)，波矢 \(\vect k=(2\pi n/\lambda)\uvec k\)，\(\lambda\) 为真空波长。设光轴为 \(z\) 轴，传播方向在 \(xz\) 平面内且与 \(z\) 轴成 \(\theta\) 角，则在某个 \(z=\) 常数的平面上 \[U(x)=U_0\,\ee^{\ii k_z z}\,\ee^{\ii (2\pi n\sin\theta/\lambda)\,x}\equiv U_0'\,\ee^{\ii 2\pi f_x x},\qquad f_x=\frac{n\sin\theta}{\lambda}.\] \(U(x)\) 的实部沿 \(x\) 方向是余弦起伏，单位长度内有 \(f_x\) 个周期。我们把 \(f_x\) 叫作这个平面波在该平面上的空间频率（单位 \(\mu\mathrm{m}^{-1}\)），它是“时间频率 = 单位时间内的周期数”在空间中的类比。一般方向上 \(\vect f=(f_x,f_y)\)，\(\abs{\vect f}=n\sin\theta/\lambda\)。
由此得到全讲最重要的对应关系：传播方向 \(\Longleftrightarrow\) 横向空间频率。斜得越厉害，横向空间频率越高；但 \(\sin\theta\le1\)，所以在介质中能传播的平面波满足 \[\tag{3.2} \abs{\vect f}\le\frac{n}{\lambda}.\] 横向空间频率更高的成分对应 \(k_z^2=(2\pi n/\lambda)^2-(2\pi\abs{\vect f})^2<0\)，\(k_z\) 为虚数，场沿 \(z\) 方向指数衰减，只能存在于界面附近约一个波长之内，称为倏逝波。远处的透镜收不到它们。
光从折射率 \(n_1\) 的介质经平面界面进入 \(n_2\) 的介质，折射定律 \(n_1\sin\theta_1=n_2\sin\theta_2\) 正好说明：横向空间频率 \(n\sin\theta/\lambda\) 在界面两侧相同（界面上两侧的场必须以同样的方式沿界面起伏）。因此光穿过盖玻片、浸油等平行分层介质时，\(n\sin\theta\) 不变。显微镜物镜收光锥的大小用 \(\mathrm{NA}=n\sin\alpha\)（\(n\) 为样品与物镜之间介质的折射率，\(\alpha\) 为收光锥半角）刻画，正是因为它在各层中不变。空气中 \(\mathrm{NA}<1\)；用折射率 1.52 左右的浸油，NA 可达 1.4–1.5。
3.2 惠更斯–菲涅耳原理
只考虑电场的一个分量，把光当作标量波（标量近似）。当所涉及的角度不太大、开孔远大于波长时，这一近似很好；高 NA 物镜的焦点处偏振效应会使光斑形状改变约 10%，本讲在用到处会说明[21]。
介质均匀、线性，光为单色光。
惠更斯认为波前上每一点都是新的子波源；菲涅耳补充了“子波相互干涉”。定量形式是：已知平面 \(\Sigma\)（例如一个开孔所在的平面）上的复振幅 \(U(x',y')\)，则 \(\Sigma\) 后面一点 \(Q\) 处的复振幅为所有子波的叠加 \[\tag{3.3} U(Q)=\frac{1}{\ii\lambda_n}\iint_\Sigma U(x',y')\,\frac{\ee^{\ii kr}}{r}\,K\,\dd x'\dd y' ,\] 其中 \(r\) 是面元到 \(Q\) 的距离，\(k=2\pi/\lambda_n\)，\(\lambda_n=\lambda/n\) 为介质中波长，\(\ee^{\ii kr}/r\) 是从面元出发的球面子波，\(K\) 是一个与方向有关的倾斜因子（近轴时 \(K\approx1\)）。前因子 \(1/(\ii\lambda_n)\) 的大小与相位由“平面波通过这个公式应当复原自身”这一要求确定，不影响本讲关心的强度分布形状。
3.3 夫琅禾费近似：远场衍射就是傅里叶变换
下面从式 (3.3) 出发，看观察点很远时积分能化简成什么形式。
取开孔中心为原点，观察点 \(Q\) 在远处，坐标 \((X,Y,Z)\)，到原点距离 \(R=\sqrt{X^2+Y^2+Z^2}\)。开孔内一点 \((x',y',0)\) 到 \(Q\) 的距离为 \begin{align*} r&=\sqrt{(X-x')^2+(Y-y')^2+Z^2}\\ &=R\sqrt{1-\frac{2(Xx'+Yy')}{R^2}+\frac{x'^2+y'^2}{R^2}} . \end{align*}
对 \((1+\epsilon)^{1/2}\approx1+\epsilon/2-\epsilon^2/8\) 展开，小参量 \(\epsilon\sim\rho'/R\)（\(\rho'\) 为开孔尺寸）。保留到 \(\rho'^2/R\)： \[r\approx R-\frac{Xx'+Yy'}{R}+\frac{x'^2+y'^2}{2R}-\frac{(Xx'+Yy')^2}{2R^3}.\]
分母中的 \(r\) 只影响振幅，换成 \(R\) 的相对误差为 \(\rho'/R\)，可以忽略。指数中的 \(kr\) 影响相位，必须仔细：最后两项的相位不超过 \(k\rho'^2/(2R)\)。夫琅禾费条件是 \[\tag{3.4} R\gg\frac{\pi\rho'^2}{\lambda_n},\] 此时这两项的相位远小于 1 rad，可以略去。
剩下 \(kr\approx kR-k(x'\sin\theta_x+y'\sin\theta_y)\)，其中 \(\sin\theta_x=X/R\)、\(\sin\theta_y=Y/R\) 是观察方向的方向余弦。代入式 (3.3)， \begin{gather*} U(Q)=\frac{\ee^{\ii kR}}{\ii\lambda_nR}\iint U(x',y')\,\ee^{-\ii2\pi(f_xx'+f_yy')}\,\dd x'\dd y' ,\tag{3.5}\\ f_x=\frac{n\sin\theta_x}{\lambda},\qquad f_y=\frac{n\sin\theta_y}{\lambda}. \end{gather*}
式 (3.5) 的积分是一种标准运算，叫作 \(U(x',y')\) 的傅里叶变换。它的物理意义很直接：沿方向 \((\theta_x,\theta_y)\) 远去的光的振幅，等于开孔处场中空间频率为 \((f_x,f_y)=(n\sin\theta_x,n\sin\theta_y)/\lambda\) 的那个“余弦成分”的大小。下一节把这个说法讲清楚。
直径 1 mm 的圆孔、\(\lambda={500\,}\mathrm{nm}\)（空气）：\(\pi\rho'^2/\lambda=\pi\times({0.5\,}\mathrm{mm})^2/{500\,}\mathrm{nm}\approx{1.6\,}\mathrm{m}\)。要在几米之外才是远场。用透镜可以把“无穷远”搬到焦平面上（第 3.6 节），显微镜中正是这样做的。
3.4 傅里叶分析：最少够用的部分
从傅里叶级数说起
一个周期为 \(d\) 的函数 \(g(x)\)（例如光栅的透过率）可以写成不同空间频率的余弦与正弦之和。用复指数写最简洁： \begin{gather*} g(x)=\sum_{m=-\infty}^{\infty}c_m\,\ee^{\ii2\pi mx/d},\tag{3.6}\\ c_m=\frac1d\int_{-d/2}^{d/2}g(x)\,\ee^{-\ii2\pi mx/d}\,\dd x . \end{gather*} 第二式的来历：把第一式两边乘以 \(\ee^{-\ii2\pi m'x/d}\) 并在一个周期上积分，由于 \(\int_{-d/2}^{d/2}\ee^{\ii2\pi(m-m')x/d}\dd x=d\)（\(m=m'\)）或 \(0\)（\(m\ne m'\)，积分了整数个周期的正弦与余弦），右边只剩 \(m=m'\) 一项。若 \(g\) 是实函数，则 \(c_{-m}=c_m^*\)，第 \(m\) 项与第 \(-m\) 项合起来是一个实的余弦 \(2\abs{c_m}\cos(2\pi mx/d+\arg c_m)\)。所以，周期函数是空间频率 \(0,\ 1/d,\ 2/d,\dots\) 的余弦之和。
透光宽度为 \(d/2\)、中心在 \(x=0\) 的方波光栅：一个周期内 \(\abs{x}<d/4\) 时 \(g=1\)，否则 \(g=0\)。由式 (3.6)， \begin{gather*} c_m=\frac1d\int_{-d/4}^{d/4}\ee^{-\ii2\pi mx/d}\dd x=\frac{\sin(\pi m/2)}{\pi m}=\frac12\operatorname{sinc}\frac m2,\\ \operatorname{sinc}u\equiv\frac{\sin\pi u}{\pi u}. \end{gather*} \(c_0=1/2\)（平均透过率），\(c_{\pm1}=1/\pi\)，偶数级 \(c_{\pm2}=c_{\pm4}=\cdots=0\)，\(c_{\pm3}=-1/(3\pi)\)。图 2(a) 显示：只取 0 级与 \(\pm1\) 级，得到周期正确的余弦；加入越来越高的频率，边缘越来越陡。精细的特征（陡峭的边缘、窄的缝）由高空间频率携带。
傅里叶变换
非周期函数（例如单个狭缝）可以看作周期 \(d\to\infty\) 的极限：允许的频率 \(m/d\) 越来越密，变成连续变量 \(f\)。定义 \begin{gather*} \tilde g(f)=\int_{-\infty}^{\infty}g(x)\,\ee^{-\ii2\pi fx}\,\dd x ,\tag{3.7}\\ g(x)=\int_{-\infty}^{\infty}\tilde g(f)\,\ee^{\ii2\pi fx}\,\dd f . \end{gather*} 第一式叫傅里叶变换，第二式叫逆变换，它说 \(g(x)\) 是频率连续分布的复指数 \(\ee^{\ii2\pi fx}\) 的叠加，\(\tilde g(f)\,\dd f\) 是频率在 \(f\) 到 \(f+\dd f\) 之间那部分的“权重”。（逆变换成立的证明见数学分析教材；对本讲用到的函数，可以把它看作式 (3.6) 在 \(d\to\infty\) 时的极限：令 \(\tilde g(m/d)=d\,c_m\)，求和 \(\sum_m(\cdot)\) 乘以频率间隔 \(1/d\) 变成积分。）二维函数的变换就是对 \(x\)、\(y\) 各做一次：\(\tilde g(f_x,f_y)=\iint g(x,y)\ee^{-\ii2\pi(f_xx+f_yy)}\dd x\dd y\)。
对照式 (3.5)：远场衍射的振幅分布就是开孔处复振幅的傅里叶变换，频率与方向的关系为 \(f=n\sin\theta/\lambda\)。
下面几条性质，本讲都要用。每条都可以把定义式 (3.7) 直接代入验证。
线性：\(a g_1+b g_2\) 的变换是 \(a\tilde g_1+b\tilde g_2\)。
平移：\(g(x-x_0)\) 的变换是 \(\ee^{-\ii2\pi fx_0}\tilde g(f)\)。（令 \(x'=x-x_0\) 换元即得。）平移只改变各频率成分的相位，不改变其大小。
伸缩：\(g(x/L)\) 的变换是 \(L\,\tilde g(Lf)\)。函数在 \(x\) 方向变宽 \(L\) 倍，频谱就变窄 \(L\) 倍：越细的结构，频谱越宽。
调制：\(g(x)\ee^{\ii2\pi f_0x}\) 的变换是 \(\tilde g(f-f_0)\)。乘上一个复指数，频谱整体搬移 \(f_0\)。这是第 8 节结构光照明的数学核心。
卷积定理（证明见下）。
两个函数的卷积定义为 \[\tag{3.8} (g\otimes h)(x)=\int_{-\infty}^{\infty}g(x')\,h(x-x')\,\dd x' .\] 物理图像：把 \(g\) 看作许多点源的分布（\(x'\) 处强度 \(g(x')\)），每个点源都产生同样形状、以 \(x'\) 为中心的响应 \(h(x-x')\)，总响应是它们的叠加。成像中，\(g\) 是物，\(h\) 是点扩散函数，卷积就是“物上每一点都被模糊成一个 \(h\)”。
对式 (3.8) 做傅里叶变换，交换积分次序，并在内层积分中令 \(u=x-x'\)： \begin{align*} &\int\!\!\int g(x')h(x-x')\,\ee^{-\ii2\pi fx}\,\dd x'\dd x\\ &\quad=\int g(x')\ee^{-\ii2\pi fx'}\dd x'\int h(u)\ee^{-\ii2\pi fu}\dd u . \end{align*} 这里用了 \(\ee^{-\ii2\pi fx}=\ee^{-\ii2\pi fx'}\ee^{-\ii2\pi fu}\)。于是 \[\tag{3.9} \widetilde{g\otimes h}(f)=\tilde g(f)\,\tilde h(f).\] 反过来（把 \(x\) 与 \(f\) 的角色对调，同样的推导），两函数乘积的变换是它们变换的卷积：\(\widetilde{gh}=\tilde g\otimes\tilde h\)。
\(\delta(x)\) 是一个“无限窄、面积为 1”的尖峰的理想化：对任何连续函数 \(g\)，\(\int g(x)\delta(x-x_0)\dd x=g(x_0)\)。由定义式 (3.7)，\(\delta(x-x_0)\) 的变换是 \(\ee^{-\ii2\pi fx_0}\)。反过来，把 \(\tilde g(f)=\delta(f-f_0)\) 代入逆变换，得 \(g(x)=\int\delta(f-f_0)\ee^{\ii2\pi fx}\dd f=\ee^{\ii2\pi f_0x}\)；由于变换与逆变换一一对应，\(\ee^{\ii2\pi f_0x}\) 的变换就是 \(\delta(f-f_0)\)。于是 \begin{gather*} \cos(2\pi f_0x)=\tfrac12\left(\ee^{\ii2\pi f_0x}+\ee^{-\ii2\pi f_0x}\right)\\ \longrightarrow\ \tfrac12\left[\delta(f-f_0)+\delta(f+f_0)\right]. \end{gather*} 一个余弦只含 \(\pm f_0\) 两个频率。周期函数式 (3.6) 的变换是位于 \(f=m/d\) 的一串 \(\delta\) 峰，权重 \(c_m\)（图 2(b)）。
3.5 三个经典衍射图样
宽 \(\ell\) 的狭缝被正入射平面波照明，缝内 \(U=1\)。由式 (3.5)（只保留 \(x\) 方向）， \begin{gather*} \tilde U(f)=\int_{-\ell/2}^{\ell/2}\ee^{-\ii2\pi fx}\dd x=\frac{\sin\pi f\ell}{\pi f}=\ell\operatorname{sinc}(f\ell),\\ I(\theta)\propto\operatorname{sinc}^2\!\Big(\frac{\ell\sin\theta}{\lambda}\Big) \end{gather*} （空气中 \(n=1\)）。暗纹在 \(\ell\sin\theta=m\lambda\)（\(m=\pm1,\pm2,\dots\)），中央亮纹的角半宽 \(\sin\theta=\lambda/\ell\)：缝越窄，衍射越开（伸缩性质）。见图 3(a)。
\(N_{\mathrm s}\) 条宽 \(\ell\)、周期 \(d\) 的狭缝。透过率可以写成“单缝”与“\(N_{\mathrm s}\) 个 \(\delta\) 峰”的卷积，由卷积定理，远场振幅 = 单缝因子 × 多缝因子： \begin{align*} \tilde U(f)&=\ell\operatorname{sinc}(f\ell)\sum_{j=0}^{N_{\mathrm s}-1}\ee^{-\ii2\pi fjd}\\ &=\ell\operatorname{sinc}(f\ell)\,\ee^{-\ii\pi f(N_{\mathrm s}-1)d}\,\frac{\sin(N_{\mathrm s}\pi fd)}{\sin(\pi fd)} . \end{align*} 第二步是等比数列求和。当 \(fd\) 为整数 \(m\) 时多缝因子的模达到最大值 \(N_{\mathrm s}\)：光栅方程 \begin{gather*} d\,(n\sin\theta_m-n\sin\theta_i)=m\lambda ,\tag{3.10}\\ m=0,\pm1,\pm2,\dots \end{gather*} 这里顺便写出了斜入射（入射方向 \(\theta_i\)）的一般形式：斜入射的平面波在光栅面上带有相位 \(\ee^{\ii2\pi(n\sin\theta_i/\lambda)x}\)，由调制性质，整个频谱搬移 \(n\sin\theta_i/\lambda\)。\(N_{\mathrm s}\) 很大时，衍射光集中在一系列分立的方向上，即衍射级，第 \(m\) 级的振幅正比于傅里叶系数 \(c_m\)。见图 3(b)。
直径 \(D\) 的圆孔被正入射平面波照明，远场强度为（推导见附录 A） \[\tag{3.11} I(\theta)=I_0\left[\frac{2J_1(v)}{v}\right]^2,\qquad v=\frac{\pi D\sin\theta}{\lambda},\] 其中 \(J_1\) 是一阶贝塞尔函数，可以用积分 \(J_1(v)=\frac1\pi\int_0^\pi\cos(\varphi-v\sin\varphi)\dd\varphi\) 定义（附录 A），它像一个振幅缓慢衰减的正弦。\(J_1(v)\) 的第一个正零点为 \(v_1=3.8317\)，所以第一暗环在 \[\tag{3.12} \sin\theta_1=\frac{3.8317}{\pi}\,\frac{\lambda}{D}=1.22\,\frac{\lambda}{D}.\] 中央亮斑（Airy 盘）集中了总光能的 84%（附录 A）。
3.6 透镜把方向变成位置；数值孔径
先看空气中（\(n=1\)）的薄透镜。与光轴成 \(\theta\) 角的一束平行光，经焦距 \(F\) 的透镜后会聚到后焦面上 \(x=F\tan\theta\approx F\sin\theta\) 处（近轴，\(\theta\ll1\)）。由第 3.1 节，物面上的场可以分解为许多平面波，空间频率为 \(f_x\) 的那个平面波沿 \(\sin\theta=\lambda f_x\) 的方向传播，因而会聚到 \[\tag{3.13} x_{\mathrm{BFP}}=\lambda F f_x .\] 所以后焦面上的每一点对应物面场的一个空间频率。若物恰好放在透镜的前焦面上，可以证明后焦面上的复振幅分布严格正比于物面场的傅里叶变换；物不在前焦面时，后焦面上的场还要乘一个随位置二次变化的相位因子（相位 \(\propto x_{\mathrm{BFP}}^2\)），强度分布不变[22]。显微镜正是把样品放在物镜前焦面附近。这相当于把式 (3.5) 中的“无穷远”搬到了焦平面上。
高 NA 物镜的收光角很大，近轴近似不再成立。设计良好的显微物镜满足阿贝提出的正弦条件：从焦点出发、与光轴成 \(\theta\) 角的光线，离开物镜后与光轴的距离正比于 \(n\sin\theta\)。于是后焦面（光瞳）上的径向坐标严格正比于 \(n\sin\theta=\lambda\abs{\vect f}\)，“光瞳上的位置 = 空间频率”的对应不依赖近轴近似[22], [23]。物镜能收集的最大空间频率是 \[\tag{3.14} \abs{\vect f}_{\max}=\frac{n\sin\alpha}{\lambda}=\frac{\mathrm{NA}}{\lambda},\] 它对应后焦面上光阑（光瞳）的边缘。
4 阿贝成像理论与衍射极限
4.1 物体是许多光栅的叠加
设物是一张薄的透明片，振幅透过率为 \(T(x,y)\)：照明光的复振幅经过它后乘以 \(T\)。由式 (3.7) 的逆变换， \[T(x,y)=\iint\tilde T(f_x,f_y)\,\ee^{\ii2\pi(f_xx+f_yy)}\,\dd f_x\dd f_y ,\] 即任何物都可以看作许多余弦光栅的叠加，空间频率为 \((f_x,f_y)\) 的光栅（周期 \(1/\abs{\vect f}\)，条纹垂直于 \(\vect f\)）的“强度”是 \(\tilde T(\vect f)\)。物的细节越精细，所需的空间频率越高。由线性性质，只要弄清一个余弦光栅怎样成像，就弄清了任何物怎样成像。这是阿贝的出发点[1], [22]。
4.2 光栅成像：两个衍射级才能成像
照明是相干的：一束（或一系列互不相干的单个）单色平面波照到物上。
物是薄的透射光栅，周期 \(d\)，样品与物镜之间充满折射率 \(n\) 的介质；物镜的收光锥半角为 \(\alpha\)，\(\mathrm{NA}=n\sin\alpha\)。
物镜本身无像差，只是有限大小：方向在收光锥之外的光进不了物镜。
第一步：物产生衍射。 由光栅方程 (3.10)，入射方向 \(\theta_i\) 的平面波经过光栅后分成一系列平面波（衍射级），第 \(m\) 级的方向满足 \[n\sin\theta_m=n\sin\theta_i+m\frac{\lambda}{d},\] 振幅正比于傅里叶系数 \(c_m\)。在“\(n\sin\theta\) 轴”上，各衍射级等间距排列，间距为 \(\lambda/d\)（图 4(c)）。
第二步：进入物镜的衍射级在像面上相互干涉。 物镜只收 \(\abs{n\sin\theta_m}\le\mathrm{NA}\) 的衍射级。这些平面波经物镜和筒镜（显微镜中物镜后面的第二块透镜，把物镜出射的平行光会聚到相机上成像）后又变成平面波，在像面上叠加（像面的坐标已按放大率折算回物面尺度）： \[\tag{4.1} U_{\mathrm{img}}(x)\propto\ee^{\ii2\pi n\sin\theta_i\,x/\lambda}\sum_{m:\ \abs{n\sin\theta_m}\le\mathrm{NA}}c_m\,\ee^{\ii2\pi mx/d}.\] 公共因子 \(\ee^{\ii2\pi n\sin\theta_i x/\lambda}\) 的模为 1，不影响光强。
若只收到一个衍射级（比如只有 0 级），\(I_{\mathrm{img}}=\abs{c_0}^2\) 处处相同：像是一片均匀的亮，看不到光栅。
若收到 0 级与 \(+1\) 级，\(I_{\mathrm{img}}=\abs{c_0+c_1\ee^{\ii2\pi x/d}}^2=\abs{c_0}^2+\abs{c_1}^2+2\abs{c_0c_1}\cos(2\pi x/d+\phi)\)，出现周期为 \(d\) 的条纹：光栅被“分辨”了。
所以，要看到周期为 \(d\) 的结构，至少要有两个相邻的衍射级同时进入物镜。
正入射（\(\theta_i=0\)）：0 级在窗口正中，\(\pm1\) 级在 \(\pm\lambda/d\)。要让 \(\pm1\) 级中至少一个进入，需 \(\lambda/d\le\mathrm{NA}\)： \[\tag{4.2} d_{\min}=\frac{\lambda}{\mathrm{NA}}\qquad(\text{正入射相干照明}).\]
斜照明：把 0 级移到窗口的一边（\(n\sin\theta_i=-\mathrm{NA}\)），\(+1\) 级在 \(-\mathrm{NA}+\lambda/d\)，只要它不超出另一边：\(\lambda/d\le2\mathrm{NA}\)， \[\tag{4.3} d_{\min}=\frac{\lambda}{2\mathrm{NA}}=\frac{\lambda}{2n\sin\alpha}\qquad(\text{最倾斜的照明}).\] 照明光由聚光镜提供，其数值孔径 \(\mathrm{NA_c}\) 限制了 \(\abs{n\sin\theta_i}\)，一般情形为 \(d_{\min}=\lambda/(\mathrm{NA}+\mathrm{NA_c})\)。
式 (4.3) 就是阿贝极限。取 \(\lambda={500\,}\mathrm{nm}\)、\(\mathrm{NA}=1.4\)，\(d_{\min}\approx{180\,}\mathrm{nm}\)。
上面的论证中没有出现放大倍数。被物镜挡掉的衍射级所携带的信息根本没有进入仪器，后面的目镜放大多少倍也找不回来。阿贝把超出分辨能力的放大称为“空放大”。另外注意 \(\lambda/d\) 也不能超过 \(2n\)：由式 (3.2)，周期小于 \(\lambda/(2n)\) 的光栅，其 \(\pm1\) 级在任何照明下都是倏逝波，根本传不出样品附近。
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4.3 傅里叶光学的表述：成像是低通滤波
把阿贝的图像推广到任意物。考虑图 5(a) 的“4f 系统”（两块焦距相同的透镜相距 \(2F\)，物在第一块的前焦面，像在第二块的后焦面，物到像总长 \(4F\)，故名）：物在物镜的前焦面，物镜后焦面（光瞳）上放光阑，筒镜把后焦面上的场再变换一次，在像面上成像。由第 3.6 节，后焦面上的场是物面场的傅里叶变换；筒镜再做一次变换，得到（倒立、放大的）物面场。
设正入射照明，物面场 \(U_{\mathrm{obj}}=T(x,y)\)。
后焦面上，空间频率 \(\vect f\) 处的场正比于 \(\tilde T(\vect f)\)（式 (3.5)、(3.13)）。
光阑让 \(\abs{\vect f}\le\mathrm{NA}/\lambda\) 的成分通过，挡住其余。用光瞳函数 \(P(\vect f)\) 表示：光阑内 \(P=1\)，光阑外 \(P=0\)。通过后为 \(P(\vect f)\tilde T(\vect f)\)。
筒镜做逆变换（把像面坐标按放大率折算回物面，并把倒像翻正），像的复振幅为 \[U_{\mathrm{img}}(\vect r)=\iint P(\vect f)\,\tilde T(\vect f)\,\ee^{\ii2\pi\vect f\cdot\vect r}\,\dd^2f .\]
由卷积定理 (3.9)，频域相乘等于空间域卷积： \[\tag{4.4} U_{\mathrm{img}}=T\otimes h,\qquad h(\vect r)=\iint P(\vect f)\,\ee^{\ii2\pi\vect f\cdot\vect r}\,\dd^2f .\]
\(h\) 叫作振幅点扩散函数：若物是一个点（\(T=\delta\)），像就是 \(h\)。\(P(\vect f)\) 叫作相干传递函数。对半径 \(\mathrm{NA}/\lambda\) 的圆形光瞳，\(h\) 就是圆孔的变换（附录 A）： \[\tag{4.5} h(r)\propto\frac{2J_1(v)}{v},\qquad v=\frac{2\pi\mathrm{NA}}{\lambda}\,r .\]
这就是阿贝理论的现代表述：成像系统是一个空间频率的低通滤波器，截止频率（相干照明）为 \(\mathrm{NA}/\lambda\)。周期 \(d\) 的光栅只有在 \(1/d\le\mathrm{NA}/\lambda\) 时才能通过，与式 (4.2) 一致。
一个可以预见的疑问：相干成像的强度像 \(\abs{U_{\mathrm{img}}}^2\) 是振幅的平方，两个振幅分量 \(\ee^{\ii2\pi\vect f_1\cdot\vect r}\)、\(\ee^{\ii2\pi\vect f_2\cdot\vect r}\) 相乘会产生差频 \(\vect f_1-\vect f_2\)，最高可达 \(2\mathrm{NA}/\lambda\)，为什么还说截止频率是 \(\mathrm{NA}/\lambda\)？因为截止是对振幅而言的：相干成像中被忠实传递的是物的振幅透过率 \(T\) 的频谱；强度像中 \(\mathrm{NA}/\lambda\) 到 \(2\mathrm{NA}/\lambda\) 之间的成分是振幅分量之间的差频，并不等于物的强度透过率 \(\abs T^2\) 在该频率的成分，甚至可能是物上根本没有的结构（例题 1(3) 的“假细节”就是一例）。更一般地，相干成像的强度像对物是非线性的（\(\abs{T\otimes h}^2\)），即使在 \(\mathrm{NA}/\lambda\) 以内，强度频谱也不等于把 \(\abs T^2\) 的频谱简单滤波的结果；只有非相干成像中“像的强度频谱 = 物的强度频谱 × OTF”才严格成立。
4.4 荧光是非相干成像：截止频率加倍
荧光显微镜中，“物”是样品里荧光分子的分布 \(C(\vect r)\)（单位面积的发光功率）。每个分子独立发光，彼此不相干。
位于 \(\vect r'\) 的一个分子，在像面上产生的复振幅是 \(h(\vect r-\vect r')\) 乘以一个随机相位因子，光强为 \(C(\vect r')\abs{h(\vect r-\vect r')}^2\)。
不同分子的随机相位彼此独立，干涉项的时间平均为零（第 3.1 节注），光强直接相加： \begin{gather*} I_{\mathrm{img}}(\vect r)=\iint C(\vect r')\,H(\vect r-\vect r')\,\dd^2r'=C\otimes H,\tag{4.6}\\ H\equiv\abs{h}^2 . \end{gather*} \(H\) 就是一个点状荧光分子的像，称为（强度）点扩散函数。
由卷积定理，像的频谱为 \(\tilde I_{\mathrm{img}}=\tilde C\cdot\tilde H\)。通常把 \(\tilde H\) 归一化，定义光学传递函数 \[\tag{4.7} \mathrm{OTF}(\vect f)=\frac{\tilde H(\vect f)}{\tilde H(0)} .\]
由式 (4.4)，\(h\) 是 \(P\) 的逆变换；\(H=h\cdot h^*\) 是一个乘积。由卷积定理的反向形式（乘积的变换 = 变换的卷积），并注意 \(h^*(\vect r)\) 的变换是 \(P^*(-\vect f)\)（取复共轭并把 \(\vect f\to-\vect f\)）， \[\tilde H(\vect f)=\iint P(\vect f')\,P^*(\vect f'-\vect f)\,\dd^2f' .\] 这是光瞳函数与它自己平移 \(\vect f\) 后的重叠积分，称为自相关。对圆形光瞳，\(P(\vect f')\) 与 \(P(\vect f'-\vect f)\) 是两个半径 \(\mathrm{NA}/\lambda\)、圆心相距 \(\abs{\vect f}\) 的圆盘，积分等于它们的重叠面积。当 \(\abs{\vect f}>2\mathrm{NA}/\lambda\) 时两圆不重叠，\(\tilde H=0\)。于是非相干成像的截止频率为 \[\tag{4.8} f_c=\frac{2\mathrm{NA}}{\lambda} .\] 重叠面积除以一个圆的面积，即得（附录 B） \begin{gather*} \mathrm{OTF}(f)=\frac2\pi\left[\arccos\frac{f}{f_c}-\frac{f}{f_c}\sqrt{1-\Big(\frac{f}{f_c}\Big)^2}\,\right],\tag{4.9}\\ 0\le f\le f_c . \end{gather*}
荧光（非相干）成像能传递的最短周期为 \(1/f_c=\lambda/(2\mathrm{NA})\)，恰与阿贝斜照明极限 (4.3) 相同。物理上，强度是振幅的平方，两个振幅分量 \(\ee^{\ii2\pi\vect f_1\cdot\vect r}\)、\(\ee^{\ii2\pi\vect f_2\cdot\vect r}\) 相乘时产生差频 \(\vect f_1-\vect f_2\)；\(\vect f_1,\vect f_2\) 各自可取到光瞳的两端，差频最大为 \(2\mathrm{NA}/\lambda\)。但 OTF 在接近 \(f_c\) 时趋于零（图 5(b)）：周期接近 \(\lambda/(2\mathrm{NA})\) 的结构虽然传过去了，对比度却很低，实际能看到的取决于噪声。
4.5 点扩散函数与瑞利判据
由式 (4.5)，一个荧光分子的像是 \[\tag{4.10} H(r)=\left[\frac{2J_1(v)}{v}\right]^2,\qquad v=\frac{2\pi\mathrm{NA}}{\lambda}r .\] 这与式 (3.11) 是同一个函数，两者的变量一一对应：圆孔衍射中的（远场空间频率 \(\sin\theta/\lambda\)，孔半径 \(D/2\)）对应显微 PSF 中的（焦面位置 \(r\)，光瞳的频率半径 \(\mathrm{NA}/\lambda\)）。由 \(J_1\) 的第一个零点 \(v_1=3.8317\)，第一暗环半径和半高全宽分别为 \begin{gather*} r_{\mathrm R}=\frac{3.8317}{2\pi}\frac{\lambda}{\mathrm{NA}}=0.61\frac{\lambda}{\mathrm{NA}},\tag{4.11}\\ w_0=0.51\frac{\lambda}{\mathrm{NA}}\approx\frac{\lambda}{2\mathrm{NA}} . \end{gather*} （半高全宽由 \([2J_1(v)/v]^2=1/2\) 的数值解 \(v=1.6163\) 得到。）
两个强度相同的非相干点光源，相距 \(\Delta x\)，像为两个 Airy 斑之和。
瑞利判据：一个斑的中心落在另一个斑的第一暗环上，\(\Delta x=r_{\mathrm R}=0.61\lambda/\mathrm{NA}\)，算作“刚好可分辨”。此时两峰之间中点的强度是峰值的 73.5%（图 6(b)），人眼能看出凹陷。
斯帕罗判据[24]：再靠近，凹陷消失、中点处曲率变为零，\(\Delta x=0.47\lambda/\mathrm{NA}\)（数值求解 \(\partial^2I/\partial x^2=0\)）。
两个判据都是约定，不是物理定律；它们和截止周期 \(\lambda/(2\mathrm{NA})\) 是同一量级，描述的是同一个限制的不同侧面。
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4.6 为什么“更亮的光”“更好的算法”都越不过截止频率
在式 (4.6) 描述的线性成像中，像的频谱 \(\tilde I_{\mathrm{img}}(\vect f)=\mathrm{OTF}(\vect f)\,\tilde C(\vect f)\,\tilde H(0)\)。对 \(\abs{\vect f}>f_c\)，OTF 等于零。
信息丢失，而不是被噪声淹没：取任意一个只含 \(\abs{\vect f}>f_c\) 成分的函数 \(\Delta C(\vect r)\)（例如周期 100 nm 的余弦起伏；只要 \(C\) 本身含足够大的常数，\(C+\Delta C\ge0\) 就仍是合理的浓度分布），物 \(C\) 与 \(C+\Delta C\) 的像完全相同。即使没有一点噪声，也不可能从像判断物是哪一个。
增大光强只是把 \(C\) 整体乘一个常数，\(\mathrm{OTF}\) 的零区不变。
去卷积等算法可以把 \(0<\mathrm{OTF}<1\) 的区域“放大”回来（相当于除以 OTF），但除以零是不可能的。
若事先知道物只占据有限区域，数学上它的频谱是“解析函数”（处处可以展开成收敛的泰勒级数的函数；知道它在任意一小段区间上的值，就确定了它在所有地方的值），原则上可由截止频率以内的频谱唯一延拓出去。但这种延拓对噪声极其敏感，所需信噪比随要扩展的频率范围指数增长，实际上不可行[22]。这正说明：要越过截止频率，必须引入新的物理或强的先验知识。
上面的论证依赖三个前提：(i) 发光强度与照明光强成正比（线性）；(ii) 对物一无所知；(iii) 照明是均匀的。分别放弃其中一个，就得到三类超分辨方法：
放弃 (i)：利用荧光的饱和，使有效点扩散函数变窄 —— STED（第 6 节）、非线性 SIM；
放弃 (ii)：已知“这一帧里亮的是一个个孤立的点”，位置就能测得比光斑小得多 —— 单分子定位（第 7 节）；
放弃 (iii)：用条纹照明与样品频率相乘，把截止频率外的成分搬进通带 —— SIM（第 8 节）。
另一类方法（近场扫描光学显微）把探针放到样品表面几十纳米内，直接收集倏逝波，绕开了“远场”这个前提，本讲不讨论。
5 荧光、受激辐射与饱和
5.1 荧光分子的能级
有机染料分子或荧光蛋白的电子能级之间间隔约 2 eV～3 eV（对应可见光）。每个电子能级上又叠加着一组间隔约 0.1 eV～0.2 eV 的振动子能级（分子中原子的振动）。记电子基态为 \(S_0\)，第一电子激发态为 \(S_1\)（图 7(a)）。
吸收：分子吸收一个光子，从 \(S_0\) 的最低振动能级跃迁到 \(S_1\) 的某个较高振动能级。
振动弛豫：多余的振动能在约 1 ps 内以热的形式交给周围溶剂，分子落到 \(S_1\) 的最低振动能级。
荧光：分子从 \(S_1\) 自发地跃迁到 \(S_0\) 的某个振动能级，发出一个光子；随后再经振动弛豫回到 \(S_0\) 最低振动能级。因为吸收与发射之间损失了振动能，荧光波长比激发光长（斯托克斯位移）；因为发射可以终止于 \(S_0\) 的不同振动能级，荧光是一个宽的光谱带。
荧光寿命 \(\tau\)：处在 \(S_1\) 的分子单位时间内离开 \(S_1\) 的概率为 \(1/\tau\)（包括发光与不发光两种途径）。常见染料与荧光蛋白 \(\tau\approx{1\,}\mathrm{ns}\)～5 ns，例如罗丹明 6G 在水中为 4.08 ns、荧光素为 4.0 ns[25]。发光途径所占比例叫量子产率，好的染料接近 1。
光强为 \(I\)、频率为 \(\nu\) 的光，单位时间穿过单位面积的光子数（光子通量密度）为 \(\Phi=I/(h\nu)\)。一个分子单位时间吸收的光子数正比于 \(\Phi\)，写成 \[\tag{5.1} k_{\mathrm a}=\sigma_{\mathrm a}\Phi=\frac{\sigma_{\mathrm a}I}{h\nu},\] 比例系数 \(\sigma_{\mathrm a}\) 具有面积量纲，叫吸收截面：可以想象分子是一个面积为 \(\sigma_{\mathrm a}\) 的“靶”，落在靶上的光子都被吸收。化学中常用摩尔消光系数 \(\varepsilon\)（比尔定律 \(I=I_010^{-\varepsilon cl}\)，\(c\) 为摩尔浓度，\(l\) 为光程）。比较 \(\dd I/\dd l=-\sigma_{\mathrm a}n_{\mathrm m}I\)（\(n_{\mathrm m}\) 为分子数密度）与 \(\dd I/\dd l=-(\ln10)\varepsilon cI\)，得 \(\sigma_{\mathrm a}=(\ln10)\varepsilon/(1000N_{\mathrm A})\)，即 \(\sigma_{\mathrm a}/\mathrm{cm^2}=3.82\times10^{-21}\,\varepsilon/(\mathrm{L\,mol^{-1}cm^{-1}})\)。例如罗丹明 6G 在 530 nm 处 \(\varepsilon={1.16\times 10^{5}}\,\mathrm{L\,mol^{-1}cm^{-1}}\)[26]，\(\sigma_{\mathrm a}={4.4\times 10^{-16}\,}\mathrm{cm^2}\)，约为分子几何截面（\(\sim{1\,}\mathrm{nm^2}={10^{-14}\,}\mathrm{cm^2}\)）的百分之几。
5.2 自发辐射与受激辐射
处在激发态的分子，除了自发发光，还可以在一个频率合适的入射光子“诱导”下跃迁到低能级，同时发出一个与入射光子频率、传播方向、偏振、相位都相同的光子：一个光子进去，两个相同的光子出来（图 7(a) 红色箭头）。这就是受激辐射，也是激光的工作原理。爱因斯坦 1917 年从热平衡的要求推出：对同一对能级、同一频率，受激辐射与吸收的单位光子通量下的跃迁概率相等（两能级简并度相同时）。仿照式 (5.1)，受激辐射速率写成 \[\tag{5.2} k_{\mathrm{se}}=\frac{\sigma_{\mathrm{se}}I_{\mathrm{STED}}}{h\nu_{\mathrm{STED}}},\] \(\sigma_{\mathrm{se}}\) 为受激辐射截面，它大致随该波长处荧光光谱的强度而变（荧光强的波长，受激辐射也强）；有机染料在荧光谱带的长波一侧的典型值为 \(\sigma_{\mathrm{se}}\sim{10^{-17}\,}\mathrm{cm^2}\)[27]。它比第 5.1 节的吸收截面（\(\sim{4\times 10^{-16}\,}\mathrm{cm^2}\)）小一个量级，与爱因斯坦关系并不矛盾：“两者相等”只对同一对能级、同一频率成立；分子的谱带很宽，吸收截面是在吸收峰处取值，而耗尽光工作在荧光谱的长波尾部，那里的跃迁强度小得多。
STED 中耗尽光的波长选在荧光谱带的长波端（例如激发 640 nm、耗尽 775 nm）。(1) 此波长的光子能量低于 \(S_0\to S_1\) 吸收所需，基本不能把基态分子激发上去；(2) 受激辐射把分子送到 \(S_0\) 的较高振动能级，后者在约 1 ps 内弛豫到最低振动能级，来不及被同一束光“激发回去”。于是从 \(S_1\) 到 \(S_0\) 的耗尽是单向的：\(S_1\)、\(S_0\) 两个电子能级加上各自快速弛豫的振动能级，等效于一个“四能级系统”。另外，受激辐射出的光子与耗尽光同波长、同方向，用滤光片就能挡掉，探测器只收自发荧光。
5.3 速率方程
在时间 \(\dd t\) 内，\(S_0\) 上的分子以概率 \(k_{\mathrm a}\dd t\) 被激发，\(S_1\) 上的分子以概率 \((1/\tau+k_{\mathrm{se}})\dd t\) 回到 \(S_0\)。于是 \[\tag{5.3} \dv{p_1}{t}=k_{\mathrm a}(1-p_1)-\Big(\frac1\tau+k_{\mathrm{se}}\Big)p_1 .\] 分子发出自发荧光光子的速率正比于 \(p_1\)。
只有激发光（\(k_{\mathrm{se}}=0\)）、连续照明，稳态 \(\dd p_1/\dd t=0\)： \[\tag{5.4} p_1=\frac{k_{\mathrm a}}{k_{\mathrm a}+1/\tau}=\frac{I/I_{\mathrm{sat}}}{1+I/I_{\mathrm{sat}}},\qquad I_{\mathrm{sat}}=\frac{h\nu}{\sigma_{\mathrm a}\tau}.\] 弱光（\(I\ll I_{\mathrm{sat}}\)）时 \(p_1\approx I/I_{\mathrm{sat}}\)，荧光与光强成正比——这就是“线性成像”的前提；强光时 \(p_1\to1\)，荧光不再增加，称为饱和。\(I_{\mathrm{sat}}\) 的含义：在这个光强下，激发速率恰好等于自发衰减速率 \(1/\tau\)。数值：罗丹明 6G，\(\sigma_{\mathrm a}={4.4\times 10^{-16}\,}\mathrm{cm^2}\)、\(\tau={4.08\,}\mathrm{ns}\)、\(\lambda={530\,}\mathrm{nm}\)（\(h\nu={3.75\times 10^{-19}\,}\mathrm{J}\)），\(I_{\mathrm{sat}}\approx{2.1\times 10^{5}\,}\mathrm{W/cm^2}\)。把 1 mW 聚焦到 \({0.1\,}\mathrm{\mu m^2}\) 就有 \({10^{6}\,}\mathrm{W/cm^2}\)，已经饱和。
STED 常用脉冲光。设 \(t=0\) 时一个极短的激发脉冲使 \(p_1=p_1(0)\)；紧接着一个宽度为 \(\tau_p\)、光强为 \(I\)（脉冲期间近似恒定）的耗尽脉冲。脉冲期间没有激发光，式 (5.3) 变为 \(\dd p_1/\dd t=-(1/\tau+k_{\mathrm{se}})p_1\)，解为 \[p_1(\tau_p)=p_1(0)\,\ee^{-\tau_p/\tau}\,\ee^{-k_{\mathrm{se}}\tau_p}.\] 脉冲之后分子照常自发发光，发出的荧光光子数正比于 \(p_1(\tau_p)\)。与没有耗尽光时相比，荧光被乘上因子（剩余荧光概率） \[\tag{5.5} \eta=\ee^{-k_{\mathrm{se}}\tau_p}=\exp\!\Big(-\frac{I}{I_s}\Big),\] \[\tag{5.6} I_s=\frac{h\nu_{\mathrm{STED}}}{\sigma_{\mathrm{se}}\tau_p}\qquad(\text{脉冲耗尽的饱和光强}).\] 推导用了两个条件：\(\tau_p\ll\tau\)（脉冲期间自发衰减可略，\(\ee^{-\tau_p/\tau}\approx1\)，且这段时间里发出的少量荧光可略，或用时间门剔除：探测器只计耗尽脉冲结束之后到达的光子）；\(\tau_p\) 远长于振动弛豫时间（约 1 ps，否则被送到 \(S_0\) 高振动能级的分子会被同一脉冲受激吸收而重新激发）。实际 \(\tau_p\) 取 0.1–1 ns。\(I\tau_p\) 是脉冲的能流密度，所以式 (5.5) 也常写成 \(\eta=\exp(-\sigma_{\mathrm{se}}J/h\nu)\)，\(J\) 为单个脉冲的能流密度。
激发光与耗尽光都连续照射，且激发很弱（\(k_{\mathrm a}\ll1/\tau\)）。稳态时由式 (5.3)，\(p_1\approx k_{\mathrm a}/(1/\tau+k_{\mathrm{se}})\)；与 \(k_{\mathrm{se}}=0\) 时相比， \begin{gather*} \eta=\frac{1}{1+k_{\mathrm{se}}\tau}=\frac{1}{1+I/I_s},\\ I_s=\frac{h\nu_{\mathrm{STED}}}{\sigma_{\mathrm{se}}\tau}\qquad(\text{连续耗尽}).\tag{5.7} \end{gather*}
两种情形下 \(I_s\) 都是“受激辐射速率 × 分子可供耗尽的时间 = 1”的光强：脉冲情形可供耗尽的时间是 \(\tau_p\)，连续情形是寿命 \(\tau\)。\(I\gg I_s\) 时荧光几乎被完全“关掉”；脉冲时随 \(I\) 指数下降，连续时只按 \(1/I\) 下降（图 7(b)）。这种强烈的非线性——荧光对耗尽光强度的依赖不是线性的——正是 STED 越过衍射极限的关键。上面三个解析式都已用式 (5.3) 的数值积分核对（scripts/fig_levels.py）。
6 STED：用环形光把光斑“削”小
6.1 原理
STED 显微镜是在共聚焦显微镜的基础上改造的。共聚焦显微镜是一台扫描显微镜：一个聚焦光斑在样品上逐点移动，每个位置记录一次荧光总量，组成图像；探测器前放一个小针孔，只让焦点附近发出的荧光通过（主要作用是挡掉焦面上下的杂散荧光，横向分辨率仍受衍射限制）。它的光斑由两束脉冲光叠加而成[6], [8]：
激发光：普通聚焦光斑，强度分布为 \(H_{\mathrm{exc}}(r)\)（式 (4.10)，半高全宽 \(w_0\approx\lambda_{\mathrm{exc}}/(2\mathrm{NA})\)），把光斑内的分子激发到 \(S_1\)；
耗尽光：紧接着到达的一束“环形”光，中心强度为零，四周很强。环上的分子被受激辐射强迫回到基态，发不出荧光；只有中心零点附近的分子保留激发态。
所以，“能发荧光的区域”只剩环形光零点周围一个小区域。耗尽光越强，被关掉的区域越向中心逼近，这个小区域就越小。图 8 是 2000 年的实验结果：荧光随耗尽光强度迅速下降，光斑被显著压缩。
6.2 环形光：涡旋相位与中心零点
怎样得到中心严格为零的光斑？最常用的办法是在物镜光瞳处加一块涡旋相位板：光瞳上方位角为 \(\varphi\) 的点，相位延迟 \(\varphi\)，绕光轴一周相位增加 \(2\pi\)（图 9(a)）。
由式 (4.4)，焦面上的振幅是光瞳函数的逆变换。加了相位板后光瞳函数为 \(P(\vect f)\ee^{\ii\varphi_f}\)（\(\varphi_f\) 是 \(\vect f\) 的方位角）： \[h_{\mathrm v}(\vect r)=\iint P(\vect f)\,\ee^{\ii\varphi_f}\,\ee^{\ii2\pi\vect f\cdot\vect r}\,\dd^2f .\]
中心：\(\vect r=0\) 时 \(h_{\mathrm v}(0)=\int_0^{\mathrm{NA}/\lambda}f\,\dd f\int_0^{2\pi}\ee^{\ii\varphi_f}\dd\varphi_f=0\)。光瞳上相对的两点（\(\varphi_f\) 与 \(\varphi_f+\pi\)）到达焦点时相位相反，两两抵消。这个零点由对称性保证，不依赖光强。
中心附近：设 \(\vect r=r(\cos\psi,\sin\psi)\)，\(r\ll\lambda/\mathrm{NA}\)。展开 \(\ee^{\ii2\pi\vect f\cdot\vect r}\approx1+\ii2\pi fr\cos(\varphi_f-\psi)\)（小参量 \(2\pi fr\le2\pi\mathrm{NA}\,r/\lambda\)）。第一项给出零（上一步）。第二项中 \(\cos(\varphi_f-\psi)=\frac12[\ee^{\ii(\varphi_f-\psi)}+\ee^{-\ii(\varphi_f-\psi)}]\)，与 \(\ee^{\ii\varphi_f}\) 相乘后，只有 \(\ee^{-\ii(\varphi_f-\psi)}\) 那一半对 \(\varphi_f\) 积分不为零（得 \(2\pi\ee^{\ii\psi}\)）： \[h_{\mathrm v}(\vect r)\approx\ii2\pi r\cdot\tfrac12\cdot2\pi\ee^{\ii\psi}\int_0^{\mathrm{NA}/\lambda}f^2\dd f=\ii\,\frac{2\pi^2}{3}\Big(\frac{\mathrm{NA}}{\lambda}\Big)^3 r\,\ee^{\ii\psi}.\] 振幅正比于 \(r\)，所以强度正比于 \(r^2\)：中心附近是一个抛物线形的“碗底”。
完整的径向分布需要数值积分或贝塞尔函数（附录 C）。结果是：峰值在 \(r=0.39\lambda/\mathrm{NA}\) 处，中心附近 \[\tag{6.1} I_{\mathrm{STED}}(r)\approx I_{\max}\Big(\frac{r}{r_0}\Big)^2,\qquad r_0=0.243\,\frac{\lambda_{\mathrm{STED}}}{\mathrm{NA}},\] \(I_{\max}\) 是环上的峰值强度，\(r_0\) 是“抛物线外推到 \(I_{\max}\)”处的半径（比峰值半径小）。环的峰值强度只有同功率普通聚焦光斑中心强度的 26%。
高 NA 物镜的焦点处，光的偏振方向会随入射角改变（标量近似不再严格）。若用线偏振的耗尽光，焦点中心会残留可观的纵向电场，零点“填不满”。实验中用与涡旋方向匹配的圆偏振光，中心的各电场分量仍相互抵消[21], [28]。
6.3 有效点扩散函数的宽度
激发光很弱（不饱和），激发概率正比于 \(H_{\mathrm{exc}}(r)\)；
耗尽脉冲满足式 (5.5) 的条件，剩余荧光概率 \(\eta(r)=\exp[-I_{\mathrm{STED}}(r)/I_s]\)；
探测器收集分子发出的全部荧光（不管分子在哪里）。实际的 STED 显微镜前有共聚焦针孔，有效 PSF 应再乘以探测 PSF \(H_{\mathrm{det}}\)；只要针孔足够大（约一个 Airy 斑直径以上），\(H_{\mathrm{det}}\) 在 \(H_{\mathrm{eff}}\) 的宽度（几十纳米）内近似为常数，可以略去。这也是为什么在 STED 中针孔对分辨率的作用很小，主要用来压低远离中心处的微弱荧光与杂散光。
在这些条件下，位于 \(\vect r\) 的分子在扫描到原点时贡献的荧光正比于 \(H_{\mathrm{exc}}(r)\eta(r)\)。这个乘积就是 STED 的有效点扩散函数 \[\tag{6.2} H_{\mathrm{eff}}(r)=H_{\mathrm{exc}}(r)\,\exp\!\Big[-\frac{I_{\mathrm{STED}}(r)}{I_s}\Big].\] 图像仍是分子分布与 \(H_{\mathrm{eff}}\) 的卷积。
为了得到解析式，做两个近似：
用半高全宽相同的高斯函数近似激发光斑：\(H_{\mathrm{exc}}(r)\approx\exp(-4\ln2\,r^2/w_0^2)\)，\(w_0=0.51\lambda_{\mathrm{exc}}/\mathrm{NA}\)。可以验证 \(r=w_0/2\) 时它等于 \(1/2\)。
用式 (6.1) 的抛物线近似环形光。这一近似在 \(r\ll r_0\) 时成立；耗尽光足够强时 \(H_{\mathrm{eff}}\) 只在 \(r\ll r_0\) 内不为零，近似自洽。
记 \(\zeta=I_{\max}/I_s\)。代入式 (6.2)，两个指数合并： \[H_{\mathrm{eff}}(r)\approx\exp\!\Big[-r^2\Big(\frac{4\ln2}{w_0^2}+\frac{\zeta}{r_0^2}\Big)\Big].\] 它仍是高斯函数。令它等于 \(1/2\)，半高全宽 \(w\) 满足 \((w/2)^2(4\ln2/w_0^2+\zeta/r_0^2)=\ln2\)，即 \begin{gather*} \boxed{w=\frac{w_0}{\sqrt{1+\beta\zeta}}},\tag{6.3}\\ \beta=\frac{w_0^2}{4\ln2\,r_0^2}=1.62\Big(\frac{\lambda_{\mathrm{exc}}}{\lambda_{\mathrm{STED}}}\Big)^2 . \end{gather*} 最后一步代入了 \(w_0=0.514\lambda_{\mathrm{exc}}/\mathrm{NA}\) 与 \(r_0=0.243\lambda_{\mathrm{STED}}/\mathrm{NA}\)。
\(\zeta=0\)（无耗尽光）：\(w=w_0\)，回到衍射极限。\(\zeta\gg1\)：\(w\approx w_0/\sqrt{\beta\zeta}\propto I_{\max}^{-1/2}\)，原则上可以任意小——分辨率不再受衍射限制，而受可用光强与分子耐受力的限制。
量纲：\(\zeta\)、\(\beta\) 都无量纲，\(w\) 与 \(w_0\) 同量纲。
与精确数值比较：用精确的 Airy 激发斑与精确的环形光（附录 C），数值求 \(H_{\mathrm{eff}}\) 的半高全宽（图 10(b) 红点）。\(\lambda_{\mathrm{STED}}=\lambda_{\mathrm{exc}}\) 时，式 (6.3) 在 \(\zeta\ge1\) 时偏差 \(\le6\%\)，\(\zeta\ge3\) 时 \(\le3.3\%\)，\(\zeta\ge10\) 时 \(\le1.3\%\)。偏差来自小 \(\zeta\) 时抛物线近似超出适用范围。
常见写法：文献中常写成 \(w\approx\lambda/(2\mathrm{NA}\sqrt{1+I_{\max}/I_s})\)[27], [29]。它与式 (6.3) 的差别只是把 \(\beta\) 吸收进 \(I_s\) 的定义（典型的 \(\lambda_{\mathrm{STED}}/\lambda_{\mathrm{exc}}\approx1.2\) 时 \(\beta\approx1.1\)，本来就接近 1）。Westphal 与 Hell 用驻波型耗尽光的模型给出 \(w\approx0.45\lambda/(\mathrm{NA}\sqrt{1+\zeta})\)，并把 \(I_s\) 定义为荧光降到 \(1/\ee\) 时的光强[30]，与式 (5.5) 一致。比较不同文献的 \(I_s\) 数值时，要注意它们的定义可能相差这样的因子。
饱和光强的数值核对：Rittweger 等人报告金刚石氮–空位色心 \(\sigma_{\mathrm{se}}\approx{1.2\times 10^{-17}\,}\mathrm{cm^2}\)、耗尽脉冲宽 3.2 ns、\(\lambda_{\mathrm{STED}}={775\,}\mathrm{nm}\)、\(I_s={6.6\,}\mathrm{MW/cm^2}\)[9]；由式 (5.6)，\(I_s=h\nu/(\sigma_{\mathrm{se}}\tau_p)={6.7\,}\mathrm{MW/cm^2}\)，一致。注意 NV 色心的寿命为 11.6 ns，\(\tau_p/\tau=0.28\)，“\(\tau_p\ll\tau\)”只是勉强满足；但脉冲期间的自发衰减因子 \(\ee^{-\tau_p/\tau}\) 在有、无耗尽光时相同，在 \(\eta\) 的比值中相消，所以式 (5.5) 仍可近似使用（若不作时间门控，还要考虑脉冲期间发出的荧光，见例题 2）。
耗尽光的强度分布 \(I_{\mathrm{STED}}(r)\) 本身受衍射限制（只含 \(\abs{\vect f}\le2\mathrm{NA}/\lambda\) 的空间频率），但 \(\exp(-I_{\mathrm{STED}}/I_s)\) 是它的非线性函数。由泰勒展开 \(\ee^{-x}=1-x+x^2/2-\cdots\)，\(I_{\mathrm{STED}}^2\)、\(I_{\mathrm{STED}}^3\) 等项的频谱分别延伸到 \(2f_c\)、\(3f_c\) \(\cdots\)（两函数乘积的频谱是两频谱的卷积，宽度相加）。所以 \(H_{\mathrm{eff}}\) 含有任意高的空间频率，第 4.6 节的前提 (i) 被打破了。
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6.4 需要多强的光？实际限制
由式 (6.3)，要把分辨率从 \(w_0\approx{230\,}\mathrm{nm}\) 提高到 30 nm，需要 \(\beta\zeta\approx(230/30)^2-1\approx60\)，即环上峰值强度约为饱和光强的 50 倍以上。代入典型参数（例题 2），脉冲 STED 的平均功率约为几十毫瓦，峰值强度达每平方厘米几百兆瓦。随之而来的限制：
光漂白与光损伤：分子在强光下被反复激发、受激，进入三重态或发生光化学反应而永久失去荧光；活细胞也受不了太强的光。
零点不完美：光学像差、偏振误差使中心残留一点强度 \(\epsilon I_{\max}\)，它会关掉中心本该发光的分子，降低信号（例题 2 定量讨论）。
降低 \(I_s\)：式 (5.6)、(5.7) 说明 \(I_s\propto1/(\sigma\times\text{可供耗尽的时间})\)。若“关闭”不是靠受激辐射，而是靠把分子切换到一个寿命长达毫秒到秒的暗态（可光开关的荧光蛋白），所需光强可降低到每平方厘米几瓦到几千瓦，这类方法统称 RESOLFT（reversible saturable optical fluorescence transitions，“可逆可饱和的光学荧光跃迁”：用一束光把分子可逆地切换到不发光态并使之饱和）[27]。
作为参照：Westphal 与 Hell 用约 800 MW/cm2 的环形耗尽光（\(\zeta\approx36\)）得到 30–35 nm 的光斑[30]；在耐受强光的金刚石氮–空位色心上，用 8.6 GW/cm2 的一维耗尽光达到了 5.8 nm[9]。生物样品中受光漂白限制，STED 的分辨率一般为几十纳米。
7 单分子定位：测“中心”比测“宽度”准得多
7.1 前置：随机变量、方差与泊松分布
随机变量 \(X\) 以概率密度 \(p(x)\) 取值（\(p(x)\dd x\) 是 \(X\) 落在 \(x\) 到 \(x+\dd x\) 之间的概率）。它的期望（平均值）与方差为 \begin{gather*} \avg{X}=\int xp(x)\,\dd x,\\ \operatorname{Var}X=\avg{(X-\avg X)^2}=\avg{X^2}-\avg{X}^2 , \end{gather*} 标准差 \(\sqrt{\operatorname{Var}X}\) 刻画 \(X\) 偏离平均值的典型幅度。对离散变量，把积分换成求和。
\(\operatorname{Var}(cX)=c^2\operatorname{Var}X\)（\(c\) 为常数），由定义直接可得。
若 \(X\)、\(Y\) 相互独立（一个的取值不影响另一个的概率分布），则 \(\avg{XY}=\avg X\avg Y\)，于是 \begin{align*} \operatorname{Var}(X+Y)&=\operatorname{Var}X+\operatorname{Var}Y+2\avg{(X-\avg X)(Y-\avg Y)}\\ &=\operatorname{Var}X+\operatorname{Var}Y , \end{align*} 交叉项因独立而等于 \(\avg{X-\avg X}\avg{Y-\avg Y}=0\)。
由前两条：\(N\) 个独立、同分布（方差 \(\sigma^2\)）的随机变量的平均值 \(\bar X=\frac1N\sum X_j\)，方差为 \(\frac1{N^2}\cdot N\sigma^2\)，即 \[\tag{7.1} \operatorname{Var}\bar X=\frac{\sigma^2}{N},\qquad \text{标准差}=\frac{\sigma}{\sqrt N}.\]
高斯（正态）分布：\(p(x)=\frac{1}{\sqrt{2\pi}\,\sigma}\ee^{-(x-x_0)^2/(2\sigma^2)}\)，期望 \(x_0\)，方差 \(\sigma^2\)；它的半高全宽为 \(2\sqrt{2\ln2}\,\sigma=2.355\sigma\)。
均匀分布：\(X\) 等可能地落在 \([-a/2,a/2]\) 内，\(p=1/a\)，期望为零，方差 \[\tag{7.2} \operatorname{Var}X=\frac1a\int_{-a/2}^{a/2}x^2\dd x=\frac{a^2}{12}.\]
在一段时间 \(t\) 内数到达探测器的光子。把 \(t\) 分成 \(J\) 个极短的小段，每段内到达一个光子的概率 \(q\) 很小（\(q\ll1\)），各段互相独立，平均光子数 \(\bar N=Jq\)。每一小段的计数 \(n_j\) 只取 0 或 1，这种变量叫伯努利变量：\(\avg{n_j}=q\)，\(\avg{n_j^2}=q\)，所以 \(\operatorname{Var}n_j=q(1-q)\)。\(J\) 个独立伯努利变量之和服从二项分布，由独立性其方差为 \(Jq(1-q)\)。这里 \[\operatorname{Var}N=J(q-q^2)\to\bar N\qquad(q\to0).\] 即光子数的方差等于其平均值，相对涨落 \(1/\sqrt{\bar N}\)。取 \(J\to\infty\) 的极限还可得到完整的分布 \(P(N)=\bar N^N\ee^{-\bar N}/N!\)（泊松分布），本讲只用到它的方差。
7.2 思想：让分子一个一个地亮
一个孤立荧光分子的像是一个宽约 250 nm 的光斑。如果视野里只有它一个，我们就知道“这个光斑来自一个点”；光斑的中心可以测得比光斑本身的宽度准得多，正如一堆散落的弹孔虽然很散，平均位置却可以算得很准。困难在于生物样品中的分子很密，许多光斑重叠在一起。2006 年 PALM、FPALM 与 STORM 的共同办法是：用可开关的荧光分子标记样品，让它们大部分时间处于不发光的“关”态；每一帧只随机地“打开”极少数分子，使它们的光斑彼此不重叠；把这些分子逐个定位，然后关闭（或漂白）；重复成千上万帧，把所有定位点画在一张图上[13], [14], [15]。开关机制有多种：PALM 用光激活荧光蛋白（紫外光把它从暗态激活）[13]；STORM 用 Cy3–Cy5 染料对，红光把 Cy5 关闭、绿光借助邻近的 Cy3 把它重新打开[15]。
它没有改变点扩散函数，而是利用了先验知识——每个光斑来自一个点——并把“同时分辨两个靠近的分子”变成“在不同时刻分别定位它们”。第 4.6 节的前提 (ii) 被打破了。
7.3 定位精度：光子统计
分子位于 \(x_0\)（只看 \(x\) 方向；\(y\) 方向完全类似）。它发出、被探测到的每个光子在像面上的落点（折算回样品面）是一个随机变量，概率密度就是归一化的点扩散函数。
各光子的落点相互独立（荧光分子每次发光都独立）。
先忽略相机像素和背景光。
点扩散函数用高斯函数近似，标准差为 \(s\)（理由见下面的注）。
探测到 \(N\) 个光子，落点为 \(x_1,\dots,x_N\)，每个的期望为 \(x_0\)、方差为 \(s^2\)。最自然的位置估计是它们的平均（质心）\(\hat x=\frac1N\sum x_j\)。\(\avg{\hat x}=x_0\)，即估计的期望等于真值，这样的估计叫无偏估计；由式 (7.1)， \[\tag{7.3} \sigma_{\mathrm{loc}}=\sqrt{\operatorname{Var}\hat x}=\frac{s}{\sqrt N}.\] 即定位误差 = 平均值的标准误。\(s\approx{100\,}\mathrm{nm}\)、\(N=1000\) 时 \(\sigma_{\mathrm{loc}}\approx{3\,}\mathrm{nm}\)。
真实的点扩散函数是 Airy 斑 (4.10)。用高斯函数对它做最小二乘拟合，得 \(s\approx0.21\lambda/\mathrm{NA}\)（按半高全宽匹配则为 \(0.22\lambda/\mathrm{NA}\)；scripts/verify_numeric.py）。需要注意：Airy 斑的外环衰减很慢（\(\propto r^{-3}\)），它的二阶矩 \(\int x^2H\,\dd^2r\) 是发散的，所以对真实 Airy 斑直接取“所有光子的平均”并不好用；实际中在一个有限区域内用模型函数拟合光斑。可以证明，对理想 Airy 斑，任何无偏估计的精度都不可能好于 \(\lambda/(2\pi\mathrm{NA}\sqrt N)\approx0.16\lambda/(\mathrm{NA}\sqrt N)\)（这是统计学中“克拉默–拉奥下限”的结果[31]，附录 D）。综合起来，定位精度写成 \(c\,\lambda/(\mathrm{NA}\sqrt N)\) 时，系数 \(c\) 取决于估计方法：最优估计（下面注中的极大似然估计）接近下限 0.16；用高斯 PSF 模型、质心法估计（本节的推导）约为 0.21；常用的高斯最小二乘拟合还要乘约 \(\sqrt{16/9}\)（第 7.4 节注），约为 0.28。对不加截断的理想 Airy 斑，质心法不收敛。
7.4 像素化与背景
相机像素的边长（折算到样品面）为 \(a\)。一个光子落在某个像素里，我们只知道它在这个像素内，于是把它记为像素中心。记录位置 = 真实落点 + 量化误差 \(u\)。当点扩散函数比像素宽（\(s\gtrsim a/2\)）、且分子相对像素格点的位置是随机的时，\(u\) 近似在 \([-a/2,a/2]\) 内均匀分布，并且与落点的高斯涨落近似独立。由方差相加与式 (7.2)，每个记录位置的方差为 \(s^2+a^2/12\)，于是 \[\tag{7.4} \sigma_{\mathrm{loc}}^2=\frac{s^2+a^2/12}{N}.\] 图 11(b) 的蒙特卡罗模拟（直接产生光子、按像素记录、取平均）在 \(a=0\)、\(s\)、\(2s\) 时都与式 (7.4) 相符到 3% 以内。（对固定的亚像素位置，\(a=2s\) 时单个光子的方差会随位置有 \(\pm3\%\) 的起伏，对位置平均后才严格等于 \(s^2+a^2/12\)；scripts/verify_numeric.py 有核对。）
实际图像上还有均匀的背景光（样品自发荧光、杂散光、相机读出噪声），设每个像素的背景计数涨落的方差为 \(b^2\)（纯泊松背景时 \(b^2\) 等于每像素平均背景光子数）。Thompson、Larson 与 Webb 对“用高斯函数做最小二乘拟合”的定位方法给出[32] \[\tag{7.5} \sigma_{\mathrm{loc}}^2=\frac{s^2+a^2/12}{N}+\frac{8\pi s^4b^2}{a^2N^2}.\] 第一项是上面推出的光子统计项，第二项来自背景。
定位相当于在光斑周围半径 \(R_{\mathrm c}\sim2s\) 的区域内求“计数加权的平均位置” \(\hat x=\sum_px_pn_p/N\)（\(n_p\) 为计数，像素坐标 \(x_p\) 从分子位置即区域中心量起）。每个像素的背景计数独立地涨落，方差 \(b^2\)，它给分子 \(\sum_px_pn_p\) 带来的方差为 \(b^2\sum_px_p^2\)。区域内有 \(\pi R_{\mathrm c}^2/a^2\) 个像素，把求和换成积分：\(\sum_px_p^2\approx\frac1{a^2}\iint x^2\dd A=\frac{\pi R_{\mathrm c}^4}{4a^2}\)。除以 \(N^2\)， \[\sigma_{\mathrm{bg}}^2\sim\frac{b^2}{N^2}\cdot\frac{\pi R_{\mathrm c}^4}{4a^2}\Big|_{R_{\mathrm c}=2s}=\frac{4\pi s^4b^2}{a^2N^2}.\] 这与式 (7.5) 第二项的形式 \(s^4b^2/(a^2N^2)\) 一致；系数 \(8\pi\) 要由最小二乘拟合的具体权重算出。两点物理含义：(1) 背景项 \(\propto1/N^2\)，光子少时它占主导，光子多时第一项占主导；(2) 区域取得越大，背景项越大。另外，背景光子平均分布在整个区域、平均位置在区域中心，它们计入分母后会把质心拉向区域中心，造成系统偏差，并按同一比例 \(N/(N+n_{\mathrm b})\)（\(n_{\mathrm b}\) 为区域内背景光子数）压缩信号光子的涨落。这两点都说明不能对整个视野求质心，而要在光斑附近拟合（或扣除背景）。
式 (7.5) 是近似结果。Mortensen 等人[33]指出：最小二乘拟合本身并不是最优的，其方差比式 (7.5) 的第一项还要大一个因子（约 \(16/9\)），而极大似然估计（选取使观测到的这组光子数据出现概率最大的参数值）可以接近理论下限。电子倍增 CCD（EMCCD）在读出前把每个光电子随机地放大成成百上千个电子，放大倍数本身有涨落，使信号的方差增大约一倍（过量噪声因子 \(F^2\approx2\)），等效于有效方差加倍。比较不同实验的定位精度时，要弄清用的是哪种相机和哪种估计方法。
7.5 图像分辨率：定位精度与标记密度
单分子定位得到的是一堆点。由它们重建的图像能分辨多细的结构，取决于两件事：
定位精度：每个点都有 \(\sigma_{\mathrm{loc}}\) 的随机偏差，一个点状物在重建图上变成标准差 \(\sigma_{\mathrm{loc}}\) 的“云”，其半高全宽 \(2.355\sigma_{\mathrm{loc}}\)。这相当于新的点扩散函数。
标记密度：结构只在有标记分子的地方被“采样”。即使每个点都定位得极准，如果标记稀疏，也看不出连续的形状（图 12(c)）。
一个只含空间频率 \(\le f_{\max}\) 的函数，只要采样间隔 \(\Delta\le1/(2f_{\max})\)，就能由样点唯一确定；采样间隔更大时，频率为 \(f\) 的成分与频率为 \(1/\Delta-f\) 的成分在样点上取值相同，无法区分（混叠，推导见附录 E）。要分辨周期为 \(d\) 的结构（\(f_{\max}=1/d\)），相邻标记的间距应不超过 \(d/2\)[34]。二维中，这要求标记的面密度至少约 \((2/d)^2\)：\(d={20\,}\mathrm{nm}\) 时为每平方微米 \(10^4\) 个分子。
每帧只能让很稀疏的分子发光（例题 3 给出估算：每平方微米约 0.26 个），而样品需要每平方微米上万个标记，所以一幅图通常要上万帧、几分钟。单分子定位用时间换取了空间分辨率，因而不适合观察快速运动的结构。
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7.6 MINFLUX：用“零点”定位
式 (7.4) 说明，用相机定位时，精度受光斑宽度 \(s\sim{100\,}\mathrm{nm}\) 的限制，要达到 1 nm 需要上万个光子。2017 年提出的 MINFLUX（名字取自 minimal photon fluxes，“最少的光子流”）反其道而行：不用分子发出的光斑找中心，而是用 STED 中那种中心为零的环形激发光去“探”分子[19]。分子越靠近零点，被激发得越少、发出的光子越少；把零点依次放在分子附近几个已知位置，比较各处的光子数，就能推出分子位置。因为零点附近强度 \(\propto r^2\) 变化很陡，位置的微小变化会引起光子数比例的显著变化。图 13 是一维的情形：零点先后放在相距 \(L\) 的两处，在两个零点之间（\(\abs{x_m}<L/2\)），两次光子数的比例随分子位置单调变化，\(L\) 越小变化越陡；在两零点之外比例会折返，同一比例对应两个位置。因此 MINFLUX 要先用相机粗定位，把分子限制在 \(L\) 的范围内，实际实现中还会加一次零点在中心的曝光来排除歧义[19]。\(L\) 可以取得远小于光斑尺寸（几十纳米），所以同样的光子数下精度高得多（定量结果见例题 3）。Balzarotti 等人取 \(L={50\,}\mathrm{nm}\)、每个分子约一千个光子，定位精度达到约 1 nm，他们在 DNA 折纸（用 DNA 链自组装成的纳米结构，可以把荧光分子安放在设计好的位置上）上分辨了相距 6 nm 的分子[19]，后来在细胞中实现了 1–3 nm 的分辨率[20]。
8 结构光照明：把高频“搬”进通带
8.1 莫尔条纹
把两块细密的网纱叠在一起，会看到粗大的、缓缓移动的波纹，这就是莫尔条纹。它的数学本质是积化和差： \begin{align*} &\cos(2\pi\vect f_1\cdot\vect r)\cdot\cos(2\pi\vect f_2\cdot\vect r)\\ &\quad=\tfrac12\cos[2\pi(\vect f_1+\vect f_2)\cdot\vect r]+\tfrac12\cos[2\pi(\vect f_1-\vect f_2)\cdot\vect r].\tag{8.1} \end{align*} 两个条纹相乘（例如光依次透过两块光栅，透过率相乘），产生和频与差频。若 \(\vect f_1\) 与 \(\vect f_2\) 相近，差频 \(\abs{\vect f_1-\vect f_2}\) 很小，对应粗大的条纹。即使两组原始条纹都细得看不清，它们的差频条纹也可能看得清。例如两组周期都为 \(\Lambda\)、夹角为 \(\Theta\) 的条纹，\(\abs{\vect f_1-\vect f_2}=2\sin(\Theta/2)/\Lambda\)，莫尔条纹周期为 \(\Lambda/[2\sin(\Theta/2)]\)，夹角越小越粗：周期 200 nm、夹角 \(5^\circ\) 的两组条纹产生周期 2.3 μm 的莫尔条纹。
8.2 结构光照明显微（SIM）
宽场荧光显微镜：整个视野同时照明，相机成像；荧光对照明光强是线性的（\(I\ll I_{\mathrm{sat}}\)，式 (5.4)）。
照明光不是均匀的，而是正弦条纹：\(I_{\mathrm{ill}}(\vect r)=I_0[1+\mu\cos(2\pi\vect f_0\cdot\vect r+\phi)]\)，\(\mu\le1\) 为调制度，\(\phi\) 为相位，二者都可控制。
把一束激光分成两束，经物镜以 \(\pm\theta\) 角（在样品介质中）射到样品上。两束平面波 \(U_\pm=\ee^{\ii k_zz}\ee^{\pm\ii2\pi(n\sin\theta/\lambda_{\mathrm{exc}})x}\) 相干叠加（偏振都垂直于入射面，使电场方向相同、干涉对比度最大）， \[\abs{U_++U_-}^2=2+2\cos\Big(2\pi\cdot\frac{2n\sin\theta}{\lambda_{\mathrm{exc}}}\,x\Big),\] 得到 \(\mu=1\) 的条纹，空间频率 \(f_0=2n\sin\theta/\lambda_{\mathrm{exc}}\)。两束光都必须通过物镜，\(n\sin\theta\le\mathrm{NA}\)，所以 \[\tag{8.2} f_0\le\frac{2\mathrm{NA}}{\lambda_{\mathrm{exc}}}.\] 照明条纹本身也受衍射限制，最细只能到截止频率附近。
发光强度 \(\mathcal E(\vect r)\) 是荧光分子密度 \(C(\vect r)\) 与照明强度之积。把余弦写成两个复指数， \begin{align*} \mathcal E(\vect r)&=C(\vect r)I_{\mathrm{ill}}(\vect r)\\ &=I_0\Big[C+\frac\mu2\ee^{\ii\phi}C\,\ee^{\ii2\pi\vect f_0\cdot\vect r}+\frac\mu2\ee^{-\ii\phi}C\,\ee^{-\ii2\pi\vect f_0\cdot\vect r}\Big]. \end{align*} 由调制性质（第 3.4 节第 4 条），各项的频谱为 \begin{align*} \tilde{\mathcal E}(\vect f)=I_0\Big[&\tilde C(\vect f)+\frac\mu2\ee^{\ii\phi}\tilde C(\vect f-\vect f_0)\\ &+\frac\mu2\ee^{-\ii\phi}\tilde C(\vect f+\vect f_0)\Big].\tag{8.3} \end{align*} 相机得到的像的频谱是 \(\mathrm{OTF}(\vect f)\tilde{\mathcal E}(\vect f)\)（式 (4.6)），只在 \(\abs{\vect f}\le f_c\) 内不为零。看第二项：像的频谱在 \(\vect f\) 处含有样品在 \(\vect f'=\vect f-\vect f_0\) 处的成分。所以，凡是满足 \(\abs{\vect f'+\vect f_0}\le f_c\) 的样品频率 \(\vect f'\)，都在这一项中被“搬”进了通带。第三项同理：样品频率 \(\vect f'\) 出现在像频谱的 \(\vect f'-\vect f_0\) 处，凡 \(\abs{\vect f'-\vect f_0}\le f_c\) 的都能被看到。图 15(a)：样品的频率 \(\vect f_s\) 在通带圆外，但 \(\vect f_s-\vect f_0\) 在圆内——这正是式 (8.1) 的差频，即莫尔条纹（图 14）。
同一像素（同一 \(\vect f\)）上，式 (8.3) 的三个未知量 \(\tilde C(\vect f)\)、\(\tilde C(\vect f-\vect f_0)\)、\(\tilde C(\vect f+\vect f_0)\) 混在一起。改变照明相位 \(\phi\) 拍三张图，\(\phi_k=0,\ 2\pi/3,\ 4\pi/3\)，得到三个方程 \[\tilde I_k=\tilde B_0+\frac\mu2\ee^{\ii\phi_k}\tilde B_++\frac\mu2\ee^{-\ii\phi_k}\tilde B_-,\qquad k=1,2,3,\] 其中 \(\tilde I_k\) 是第 \(k\) 张原始像的频谱，\(\tilde B_0=I_0\mathrm{OTF}(\vect f)\tilde C(\vect f)\)、\(\tilde B_\pm=I_0\mathrm{OTF}(\vect f)\tilde C(\vect f\mp\vect f_0)\) 是三个“频带”。系数矩阵的行列式不为零（三个相位均匀分布时，利用 \(\sum_k\ee^{\ii\phi_k}=0\) 可直接解出 \(\tilde B_0=\frac13\sum_k\tilde I_k\)、\(\tilde B_+=\frac{2}{3\mu}\sum_k\ee^{-\ii\phi_k}\tilde I_k\)，附录 F）。把分离出的 \(\tilde B_\pm\) 在频率空间移回原位（\(\tilde B_+\) 中位于 \(\vect f\) 处的是样品在 \(\vect f-\vect f_0\) 处的成分），与 \(\tilde B_0\) 拼在一起，就得到一个更大的频谱。为了在各个方向上都扩展，条纹要转三个方向（例如 0°、60°、120°），共拍 9 张原始图（图 15(b)）。
能恢复的样品频率满足 \(\abs{\vect f'}\le f_c+f_0\)。由式 (8.2)，\(f_0\) 最大为 \(2\mathrm{NA}/\lambda_{\mathrm{exc}}\)，于是 \[\tag{8.4} f_{\max}^{\mathrm{SIM}}=\frac{2\mathrm{NA}}{\lambda_{\mathrm{em}}}+\frac{2\mathrm{NA}}{\lambda_{\mathrm{exc}}}\approx2f_c,\qquad d_{\min}^{\mathrm{SIM}}\approx\frac{\lambda}{4\mathrm{NA}}.\] 上限是 2 倍，原因有两条：照明条纹本身要通过同一个受衍射限制的物镜（\(f_0\lesssim f_c\)）；发光对照明强度是线性的，照明里只有 \(0\)、\(\pm\vect f_0\) 三个频率，只能搬移 \(\pm\vect f_0\) 一次。Gustafsson 2000 年用 NA 1.4 的物镜，把肌动蛋白纤维像的宽度从约 290 nm 减小到约 115 nm[17]。它的优点是宽场成像、所需光强低（与普通荧光显微镜相当），适合活细胞。
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8.3 非线性 SIM：利用饱和产生高次谐波
要越过 2 倍，就要让照明的“有效频率”含有 \(2\vect f_0\)、\(3\vect f_0\) \(\cdots\)。线性响应做不到，非线性响应可以：若发光正比于 \(C(\vect r)F[I_{\mathrm{ill}}(\vect r)]\)，\(F\) 是非线性函数，则 \(F[I_{\mathrm{ill}}]\) 仍以 \(1/f_0\) 为周期，但不再是单纯的余弦，它的傅里叶级数含有各次谐波 \(n\vect f_0\)。每一个谐波都把样品频谱搬移 \(n\vect f_0\)，可恢复的频率扩大到 \(f_c+n_{\max}f_0\)，原则上没有上限。Gustafsson 2005 年用饱和激发实现了这一点[18]。
用宽度远小于荧光寿命的短脉冲激发，且激发前分子处于基态。脉冲期间自发衰减可以忽略，式 (5.3) 变为 \(\dd p_1/\dd t=k_{\mathrm a}(1-p_1)\)，从 \(p_1=0\) 积分到脉冲结束： \[\tag{8.5} p_1=1-\ee^{-k_{\mathrm a}t_{\mathrm{pulse}}}=1-\exp\Big(-\frac{\sigma_{\mathrm a}J}{h\nu}\Big),\] \(J\) 为脉冲能流密度。\(J\) 小时 \(p_1\approx\sigma_{\mathrm a}J/h\nu\)（线性），\(J\) 大时 \(p_1\to1\)（饱和）。照明 \(J(\vect r)=J_{\mathrm{p}}[1+\cos u]/2\)（\(u=2\pi\vect f_0\cdot\vect r\)，\(J_{\mathrm p}\) 为峰值）。记 \(\kappa=\sigma_{\mathrm a}J_{\mathrm p}/h\nu\)，对小 \(\kappa\) 做泰勒展开到二阶： \[p_1\approx x-\frac{x^2}{2},\qquad x=\frac\kappa2(1+\cos u).\] 用 \(\cos^2u=\frac12(1+\cos2u)\)，\(x^2=\frac{\kappa^2}{4}\big(\frac32+2\cos u+\frac12\cos2u\big)\)，所以 \[p_1\approx\Big(\frac\kappa2-\frac{3\kappa^2}{16}\Big)+\Big(\frac\kappa2-\frac{\kappa^2}{4}\Big)\cos u-\frac{\kappa^2}{16}\cos2u .\] 出现了二次谐波 \(\cos2u\)，振幅 \(\kappa^2/16\)，与一次谐波之比约 \(\kappa/8\)。精确的各次谐波振幅可用修正贝塞尔函数写出（附录 F），见图 15(c)。
\(n\) 次谐波的振幅在弱饱和时按 \(\kappa^n\) 增长，饱和不深时高次谐波很弱，信号很容易被噪声淹没；用到 \(n_{\max}\) 次谐波时每个方向需要 \(2n_{\max}+1\) 个相位。强饱和需要强光，荧光分子容易漂白。Gustafsson 用 532 nm、640 ps 的脉冲激发，在荧光小球样品上利用到第 3 次谐波，得到优于 50 nm 的分辨率[18]（他的饱和公式还包含了脉冲期间的自发衰减，式 (8.5) 是脉冲远短于寿命时的极限）。后来改用可光开关的荧光蛋白（类似第 6.4 节 RESOLFT 的思路），降低了所需光强。连续光饱和激发产生谐波的情形见例题 4。
8.4 三类方法的比较
表 2 从打破的前提、关键物理、分辨率、光强和速度几方面比较三类方法。
| STED | 单分子定位（PALM/STORM） | 线性 SIM | |
|---|---|---|---|
| 打破的前提 | 线性响应 | 对样品一无所知 | 均匀照明 |
| 关键物理 | 受激辐射饱和 | 光子统计 + 分子开关 | 频率搬移（莫尔） |
| 分辨率 | 几十 nm（\(\propto I_{\max}^{-1/2}\)） | 约 20 nm（\(\propto N^{-1/2}\)） | 约 100 nm（2 倍） |
| 所需光强 | 很强（\(\gg I_s\)） | 中等（需要开关与大量光子） | 弱 |
| 成像方式与速度 | 点扫描，视野小时快 | 宽场，需上万帧 | 宽场，9 帧一幅 |
9 决赛风格例题
用油浸物镜（\(\mathrm{NA}=1.30\)，浸油 \(n=1.515\)）在 \(\lambda={550\,}\mathrm{nm}\) 的绿光下观察硅藻壳上的周期性纹路（看作振幅透过率为方波、透光宽度为半个周期的光栅，周期为 \(d\)）。照明是相干的平面波。
正入射照明时，能看到条纹的最小周期是多少？
改用斜照明。若聚光镜与载玻片之间也加浸油，照明方向可达 \(n\sin\theta_i=1.30\)，最小周期是多少？若聚光镜是“干”的（与载玻片之间是空气），最小周期变为多少？说明理由。
取 \(d={600\,}\mathrm{nm}\)、正入射。列出哪些衍射级能进入物镜。若在物镜后焦面中心放一个小挡片，只挡住 0 级，像是什么样子？这对“用显微镜判断样品结构”有何警示？
硅藻壳几乎透明，更接近一个弱相位光栅：\(T(x)=\exp[\ii\phi_0\cos(2\pi x/d)]\)，\(\phi_0=0.1\)，\(d={600\,}\mathrm{nm}\)。证明在普通（明场）照明下像几乎没有衬度；若在后焦面上让 0 级多走 1/4 波长（相位延迟 \(\pi/2\)），像的衬度变为多少？
(1) 由式 (4.2)，\(d_{\min}=\lambda/\mathrm{NA}=550/1.30={423\,}\mathrm{nm}\)。
(2) 0 级与 \(+1\) 级在 \(n\sin\theta\) 轴上相距 \(\lambda/d\)。0 级在 \(n\sin\theta_i\) 处，\(+1\) 级在 \(n\sin\theta_i+\lambda/d\) 处，两者都要落在 \([-\mathrm{NA},\mathrm{NA}]\) 内。取 \(n\sin\theta_i=-\mathrm{NA_c}\)（\(\mathrm{NA_c}\le\mathrm{NA}\)），条件为 \(-\mathrm{NA_c}+\lambda/d\le\mathrm{NA}\)，得 \(d_{\min}=\lambda/(\mathrm{NA}+\mathrm{NA_c})\)。
浸油聚光镜：\(\mathrm{NA_c}=1.30\)，\(d_{\min}=550/2.60={212\,}\mathrm{nm}\)。
干聚光镜：照明光在到达样品前要穿过一层空气，而光穿过平行界面时 \(n\sin\theta\) 守恒（第 3.1 节），空气中 \(n\sin\theta<1\)，所以到达样品时仍有 \(\abs{n\sin\theta_i}<1\)，即 \(\mathrm{NA_c}<1\)。\(d_{\min}>550/(1.30+1)={239\,}\mathrm{nm}\)（实际聚光镜 \(\mathrm{NA_c}\approx0.95\) 时为 244 nm）。这就是高分辨显微观察时聚光镜也要上油的原因。
(3) \(\lambda/d=0.917\)。各级 \(n\sin\theta_m=0.917m\)：\(m=0,\pm1\) 满足 \(\abs{n\sin\theta}\le1.30\)，进入物镜；\(\abs m\ge2\) 时 \(\abs{n\sin\theta}\ge1.83>n=1.515\)，是倏逝波，根本不传播（而且方波光栅的 \(c_{\pm2}=0\)）。
挡住 0 级后，像的振幅只剩 \(\pm1\) 级：\(U\propto c_1\ee^{\ii2\pi x/d}+c_{-1}\ee^{-\ii2\pi x/d}=\frac{2}{\pi}\cos\frac{2\pi x}{d}\)（\(c_{\pm1}=1/\pi\)）， \[I\propto\cos^2\frac{2\pi x}{d}=\frac12\Big(1+\cos\frac{4\pi x}{d}\Big),\] 周期为 \(d/2={300\,}\mathrm{nm}\)：像中出现了样品上并不存在的、周期减半的条纹。阿贝的光栅实验正是用这种“在后焦面上挡住部分衍射级”的方法说明：像的样子由哪些衍射级参与干涉决定，像不一定忠实于物[1], [35]。判断精细结构时，必须知道哪些空间频率被系统传递了。
(4) 把 \(T\) 按 \(\phi_0\) 展开到一阶：\(T\approx1+\ii\phi_0\cos(2\pi x/d)=1+\frac{\ii\phi_0}{2}(\ee^{\ii2\pi x/d}+\ee^{-\ii2\pi x/d})\)，即 \(c_0=1\)、\(c_{\pm1}=\ii\phi_0/2\)。由 (3)，这三级都进入物镜。
明场：\(I=\abs{1+\ii\phi_0\cos(2\pi x/d)}^2=1+\phi_0^2\cos^2(2\pi x/d)\)。一阶项消失，因为 \(\pm1\) 级与 0 级相位差 \(\pi/2\)，干涉项 \(2\Re(c_0^*c_1\cdots)\) 为零。衬度只有二阶小量 \(\phi_0^2/2=0.005\)（而且周期为 \(d/2\)）。
0 级相位延迟 \(\pi/2\)（乘以 \(\ii\)）：\(U=\ii+\ii\phi_0\cos(2\pi x/d)=\ii[1+\phi_0\cos(2\pi x/d)]\)， \begin{gather*} I=1+2\phi_0\cos\frac{2\pi x}{d}+\order{\phi_0^2},\\ \text{衬度}\ \frac{I_{\max}-I_{\min}}{I_{\max}+I_{\min}}\approx2\phi_0=0.20 . \end{gather*} 相位起伏变成了强度起伏。这就是泽尼克（F. Zernike）的相衬显微镜原理（1953 年诺贝尔物理学奖）。用精确系数 \(c_m=\ii^mJ_m(\phi_0)\) 的数值计算给出衬度 0.198，明场衬度 \(5.0\times10^{-3}\)（scripts/examples.py）。
某染料荧光寿命 \(\tau={3.0\,}\mathrm{ns}\)，在 \(\lambda_{\mathrm{STED}}={775\,}\mathrm{nm}\) 处受激辐射截面 \(\sigma_{\mathrm{se}}={3.0\times 10^{-17}\,}\mathrm{cm^2}\)。激发波长 \(\lambda_{\mathrm{exc}}={640\,}\mathrm{nm}\)，物镜 \(\mathrm{NA}=1.40\)。耗尽光为矩形脉冲，宽 \(\tau_p={0.30\,}\mathrm{ns}\)，重复频率 \(f_{\mathrm{rep}}={40\,}\mathrm{MHz}\)，用涡旋相位板形成环形光斑。
求脉冲耗尽的饱和光强 \(I_s\)。
第 5.3 节推导式 (5.5) 时略去了耗尽脉冲期间分子自发发出的荧光。若探测器不作时间门控、这部分荧光也被计入，从速率方程 (5.3) 出发求剩余荧光比例 \(\eta(I)\)（以无耗尽光时的总荧光为 1）。证明 \(I\gg I_s\) 时 \(\eta\approx(\tau_p/\tau)(I_s/I)\)，并说明这对环形光“关掉”荧光的效果意味着什么。
要求有效光斑半高全宽 \(w={30\,}\mathrm{nm}\)（按门控情形，式 (6.3)），求 \(\zeta=I_{\max}/I_s\)、环上峰值强度 \(I_{\max}\) 和耗尽光的平均功率。（已知同功率下环形光斑满足 \(\int I\,\dd A=1.23\,I_{\max}(\lambda_{\mathrm{STED}}/\mathrm{NA})^2\)，见附录 C。）
若改用连续耗尽光（激发光也连续且很弱），达到同样的 \(w\) 需要多大的平均功率？解释两者差别的物理原因。
实际的环形光中心并非严格为零，残留强度为 \(\epsilon I_{\max}\)。求光斑中心的荧光信号与无耗尽光时之比，并计算 \(\epsilon=1\%\) 时 \(w={30\,}\mathrm{nm}\) 与 20 nm 两种情况下的值。若要求中心信号不低于无耗尽时的一半，这台仪器能达到的最小 \(w\) 是多少？
(1) \(h\nu=hc/\lambda_{\mathrm{STED}}={2.56\times 10^{-19}\,}\mathrm{J}\)。由式 (5.6)， \begin{align*} I_s&=\frac{h\nu}{\sigma_{\mathrm{se}}\tau_p}=\frac{{2.56\times 10^{-19}\,}\mathrm{J}}{({3.0\times 10^{-21}\,}\mathrm{m^2})({3.0\times 10^{-10}\,}\mathrm{s})}\\ &={2.85\times 10^{11}\,}\mathrm{W/m^2}={28\,}\mathrm{MW/cm^2}. \end{align*}
(2) 设激发后 \(p_1(0)=1\)。脉冲期间 \(\dd p_1/\dd t=-kp_1\)，\(k=k_{\mathrm{se}}+1/\tau\)，\(p_1(t)=\ee^{-kt}\)。自发荧光的发射速率为 \(p_1/\tau\)（量子产率是公共因子，略去），脉冲期间发出 \[\int_0^{\tau_p}\frac{p_1}{\tau}\dd t=\frac{1-\ee^{-k\tau_p}}{k\tau},\] 脉冲之后剩余的 \(p_1(\tau_p)=\ee^{-k\tau_p}\) 全部自发衰减。没有耗尽光时总荧光为 1（\(k=1/\tau\) 时上两项之和为 1）。所以 \begin{gather*} \eta=\ee^{-k\tau_p}+\frac{1-\ee^{-k\tau_p}}{k\tau},\\ k\tau_p=\frac{I}{I_s}+\frac{\tau_p}{\tau},\qquad k\tau=\frac{\tau}{\tau_p}\frac{I}{I_s}+1 . \end{gather*} \(I\gg I_s\) 时第一项指数地趋于零，第二项 \(\approx1/(k\tau)\approx(\tau_p/\tau)(I_s/I)\)。本题 \(\tau_p/\tau=0.1\)，在环上（\(I=I_{\max}=55I_s\)）\(\eta\approx0.1/55=1.8\times10^{-3}\)，而门控时为 \(\ee^{-55}\approx10^{-24}\)。物理上：在耗尽脉冲的前一小段时间里，分子还来不及被受激辐射“关掉”，就有一定概率先自发发出一个光子，这部分泄漏随光强只按 \(1/I\) 下降，不再是指数下降。对光斑宽度的影响不大（数值计算：\(w\) 从门控时的 30.0 nm 变为 31.0 nm，scripts/examples.py），但它给远离中心的区域留下了不随光强指数消失的“底”。实际仪器用时间门（第 5.3 节）去掉这部分荧光。
(3) 衍射极限光斑 \(w_0=0.514\lambda_{\mathrm{exc}}/\mathrm{NA}={235\,}\mathrm{nm}\)。系数 \(\beta=1.62(640/775)^2=1.10\)。由式 (6.3)， \begin{gather*} \zeta=\frac{(w_0/w)^2-1}{\beta}=\frac{(235/30)^2-1}{1.10}=55,\\ I_{\max}=\zeta I_s={1.6\,}\mathrm{GW/cm^2}. \end{gather*} （用精确 Airy 斑与精确环形光数值求解得 \(\zeta=55.1\)，差 0.5%。）环形光的总功率（脉冲期间）\(P_{\mathrm{pk}}=1.23\,I_{\max}(\lambda_{\mathrm{STED}}/\mathrm{NA})^2=1.23\times{1.56\times 10^{13}\,}\mathrm{W/m^2}\times({0.554\,}\mathrm{\mu m})^2={5.9\,}\mathrm{W}\)。每个周期只在 \(\tau_p\) 内有光，占空比 \(\tau_pf_{\mathrm{rep}}=0.012\)，平均功率 \[\bar P=P_{\mathrm{pk}}\tau_pf_{\mathrm{rep}}\approx{71\,}\mathrm{mW}.\] 这与 Westphal 与 Hell 用约 800 MW/cm2 得到 30–35 nm 光斑的量级一致[30]。
(4) 连续耗尽时 \(\eta=1/(1+I/I_s')\)，\(I_s'=h\nu/(\sigma_{\mathrm{se}}\tau)={2.85\,}\mathrm{MW/cm^2}\)（式 (5.7)）。宽度公式要重新推：仍用高斯激发斑与抛物线环形光，记 \(u=4\ln2\,r^2/w_0^2\)，则 \(\zeta I_{\mathrm{STED}}/I_{\max}=\beta\zeta u\)， \[H_{\mathrm{eff}}=\frac{\ee^{-u}}{1+\beta\zeta u}.\] 半高处 \(u_{1/2}=\ln2\,(w/w_0)^2=0.0113\)，由 \(\ee^{-u_{1/2}}/(1+\beta\zeta u_{1/2})=1/2\) 解得 \(\beta\zeta=(2\ee^{-u_{1/2}}-1)/u_{1/2}\)，\(\zeta_{\mathrm{cw}}=78.5\)（精确数值 79.0）。所需功率 \(P=1.23\,\zeta_{\mathrm{cw}}I_s'(\lambda_{\mathrm{STED}}/\mathrm{NA})^2\approx{0.84\,}\mathrm{W}\)，是脉冲平均功率的 12 倍。
为什么差这么多？把比值拆开： \[\frac{P_{\mathrm{cw}}}{\bar P}=\frac{\zeta_{\mathrm{cw}}}{\zeta}\cdot\frac{I_s'}{I_s\,\tau_pf_{\mathrm{rep}}}=\frac{\zeta_{\mathrm{cw}}}{\zeta}\cdot\frac{1}{f_{\mathrm{rep}}\tau}=1.43\times8.3 .\] 第二个因子的含义：脉冲方案中，每个周期只需在激发之后的 \(\tau_p\) 内送去能流密度约 \(\zeta h\nu/\sigma_{\mathrm{se}}\)，就能在分子自发发光之前把它关掉；连续方案中，受激辐射必须在每一时刻与自发衰减速率 \(1/\tau\) 竞争，相当于每经过一个寿命 \(\tau\) 就要送去同量级的能流。一个周期 \(1/f_{\mathrm{rep}}\) 内有 \(1/(f_{\mathrm{rep}}\tau)\approx8\) 个寿命，所以多耗约 8 倍。换一种说法：连续光的能量平均分摊在所有时刻，而一个分子在被激发之后的大约 \(\tau\) 时间内，耗尽光才对它起作用。第一个因子 \(1.43\) 来自 \(1/(1+x)\) 比 \(\ee^{-x}\)“关”得慢（图 7(b)）。
(5) 中心处 \(I_{\mathrm{STED}}=\epsilon I_{\max}=\epsilon\zeta I_s\)，由式 (5.5)，中心的荧光乘以 \(\ee^{-\epsilon\zeta}\)。\(w={30\,}\mathrm{nm}\)：\(\zeta=55\)，剩 \(\ee^{-0.55}=0.58\)；\(w={20\,}\mathrm{nm}\)：\(\zeta=[(235/20)^2-1]/1.10=124\)，剩 \(\ee^{-1.24}=0.29\)。要求 \(\ee^{-\epsilon\zeta}\ge1/2\)，即 \(\zeta\le\ln2/\epsilon=69\)，代入式 (6.3)：\(w_{\min}=w_0/\sqrt{1+\beta\cdot69}={27\,}\mathrm{nm}\)。分辨率每提高一倍，\(\zeta\) 约增大 4 倍，残余强度造成的信号损失按 \(\ee^{-\epsilon\zeta}\) 指数增长，所以零点质量直接决定了可用的最高分辨率。
单分子像用高斯函数近似，\(s={100\,}\mathrm{nm}\)；相机像素折算到样品面 \(a={100\,}\mathrm{nm}\)。
用高斯最小二乘拟合定位（式 (7.5) 适用），要使定位精度 \(\sigma_{\mathrm{loc}}={5\,}\mathrm{nm}\)，无背景时需要多少光子？若每个像素平均有 10 个背景光子（泊松涨落，\(b^2=10\)），需要多少？
要分辨周期 \(d={20\,}\mathrm{nm}\) 的结构，按奈奎斯特判据，标记的面密度至少多大？对 \({10\,}\mathrm{\mu m}\times{10\,}\mathrm{\mu m}\) 的视野，若要求每个被激活分子半径 250 nm（约 \(2.5s\)）内有另一个被激活分子的概率不超过 5%，每帧最多激活多少个分子？以每秒 100 帧采集，至少要多长时间？（设每个分子只被定位一次。被激活分子在视野内随机均匀分布时，给定区域内被激活分子数服从泊松分布。）
（MINFLUX 的一维模型）激发光强度在零点附近为 \(I(x)\propto(x-x_p)^2\)。把零点先后放在 \(x_p=-L/2\) 与 \(+L/2\)（图 13），两次曝光时间相同，分别探测到 \(n_0\)、\(n_1\) 个光子，\(n_0+n_1=N\)。分子位于 \(x_m\) 附近，由比值 \(\hat\gamma=n_0/N\) 反推 \(x_m\)。求 \(x_m=0\) 时的定位精度 \(\sigma_x\)。\(L={50\,}\mathrm{nm}\) 时，达到 1 nm 需要多少光子？与 (1) 中相机定位（无背景、\(a\to0\)）相比如何？
若每次曝光还有平均 \(n_{\mathrm b}\) 个背景光子（已知，可扣除），分子在 \(x_m=0\) 时每次曝光的信号光子平均为 \(n_{\mathrm s}\)，求定位精度，用信号光子总数 \(N=2n_{\mathrm s}\) 表示。为什么 \(L\) 不能无限缩小？
(1) 无背景由式 (7.4)：\(N=(s^2+a^2/12)/\sigma_{\mathrm{loc}}^2=(10^4+833)/25=433\)。
有背景时由式 (7.5)（\(b^2=10\)）：\(25=\dfrac{10833}{N}+\dfrac{8\pi\times10^8\times10}{10^4N^2}=\dfrac{10833}{N}+\dfrac{2.51\times10^6}{N^2}\)。乘以 \(N^2\) 得二次方程 \(25N^2-10833N-2.51\times10^6=0\)，取正根 \(N=601\)。背景使所需光子数增加约 40%。（若再按 Mortensen 等人对最小二乘的修正[33]，第一项乘以约 \(16/9\)，所需光子数还要再乘约 1.8。）
(2) 奈奎斯特：相邻标记间距 \(\le d/2={10\,}\mathrm{nm}\)，面密度 \(\rho\ge(2/{20\,}\mathrm{nm})^2=10^4\,\mu\mathrm{m}^{-2}\)；视野中共 \(10^6\) 个分子。
设每帧被激活分子的面密度为 \(\rho_a\)。一个被激活分子周围半径 \(r={0.25\,}\mathrm{\mu m}\) 的圆内，其他被激活分子数服从平均值 \(\rho_a\pi r^2\) 的泊松分布，“至少有一个”的概率为 \(1-\ee^{-\rho_a\pi r^2}\le0.05\)，得 \(\rho_a\le-\ln0.95/(\pi r^2)=0.26\,\mu\mathrm{m}^{-2}\)，每帧最多约 26 个。帧数 \(\ge10^6/26=3.8\times10^4\)，以 100 帧/秒计需约 380 s，即 6 分多钟。
(3) 两次曝光的平均光子数正比于分子处的强度：\(\avg{n_0}\propto(x_m+L/2)^2\)，\(\avg{n_1}\propto(x_m-L/2)^2\)。给定总数 \(N\)，每个光子独立地以概率 \[\gamma(x_m)=\frac{(x_m+L/2)^2}{(x_m+L/2)^2+(x_m-L/2)^2}\] 来自第一次曝光，所以 \(n_0\) 服从二项分布（第 7.1 节），\(\hat\gamma=n_0/N\) 的方差为 \(\gamma(1-\gamma)/N\)。\(x_m=0\) 时 \(\gamma=1/2\)，方差 \(1/(4N)\)。
把 \(\hat\gamma\) 的涨落换成位置的涨落要除以斜率（泰勒展开到一阶：\(\delta\hat\gamma\approx\gamma'(x_m)\,\delta x\)）。记 \(u=x_m+L/2\)、\(v=x_m-L/2\)，\(\gamma=u^2/(u^2+v^2)\)， \[\dv{\gamma}{x_m}=\frac{2u(u^2+v^2)-u^2(2u+2v)}{(u^2+v^2)^2}=\frac{2uv(v-u)}{(u^2+v^2)^2}.\] \(x_m=0\) 时 \(u=L/2\)、\(v=-L/2\)、\(v-u=-L\)，斜率 \(=\dfrac{2(L/2)(-L/2)(-L)}{(L^2/2)^2}=\dfrac{2}{L}\)。于是 \[\sigma_x=\frac{\sqrt{1/(4N)}}{2/L}=\frac{L}{4\sqrt N}.\] 蒙特卡罗核对（\(N=400\)，2 万次）：\(\sigma_x={0.624\,}\mathrm{nm}\)，理论 0.625 nm。这与 Balzarotti 等人给出的一维结果一致[19]。\(L={50\,}\mathrm{nm}\)、\(\sigma_x={1\,}\mathrm{nm}\) 需 \(N=(L/4)^2=156\)；相机定位 \(\sigma=s/\sqrt N\) 需 \(N=(s/{1\,}\mathrm{nm})^2=10^4\)，多 64 倍 \(=(4s/L)^2\)。MINFLUX 的“有效 PSF 宽度”是 \(L/4\) 而不是 \(s\)。
(4) 每次曝光的平均计数为 \(n_{\mathrm s}+n_{\mathrm b}\)，扣除已知背景后用 \(\hat\gamma=(n_0-n_{\mathrm b})/(n_0+n_1-2n_{\mathrm b})\)。在 \(x_m=0\) 处，\(\hat\gamma\) 对两次计数的偏导数分别为 \(\pm1/(4n_{\mathrm s})\)，两次计数的泊松方差都是 \(n_{\mathrm s}+n_{\mathrm b}\)，所以 \[\operatorname{Var}\hat\gamma\approx\frac{2(n_{\mathrm s}+n_{\mathrm b})}{(4n_{\mathrm s})^2}=\frac{1}{4N}\Big(1+\frac{n_{\mathrm b}}{n_{\mathrm s}}\Big),\qquad N=2n_{\mathrm s}.\] 斜率不变（背景已扣除），故 \(\sigma_x=\dfrac{L}{4\sqrt N}\sqrt{1+n_{\mathrm b}/n_{\mathrm s}}\)。蒙特卡罗（\(n_{\mathrm s}=50\)、\(n_{\mathrm b}=10\)）：1.39 nm，理论 1.37 nm。
\(L\) 越小，零点两侧的探测位置离分子越近，分子处的激发强度 \(\propto(L/2)^2\) 越小，相同曝光时间内的信号 \(n_{\mathrm s}\propto L^2\) 下降，而背景不变，\(n_{\mathrm b}/n_{\mathrm s}\propto L^{-2}\)。\(L\) 小到 \(n_{\mathrm b}/n_{\mathrm s}\gtrsim1\) 时，\(\sigma_x\propto L\cdot L^{-1}\)，精度不再随 \(L\) 改善（若靠延长曝光补足信号，背景也随之增大，比值不变）。实际 MINFLUX 中零点的残余强度起着与背景相同的作用。
本题讨论结构光照明在第 8 节之外的三个问题。
连续光饱和激发。 用连续照明代替短脉冲，分子处于激发态的稳态概率为 \(p_1=x/(1+x)\)（式 (5.4)，\(x=I/I_{\mathrm{sat}}\)）。照明 \(x=x_0(1+\cos u)\)，\(u=2\pi\vect f_0\cdot\vect r\)。
利用等比级数证明：当 \(\abs q<1\) 时 \(1+2\sum_{n\ge1}q^n\cos nu=\dfrac{1-q^2}{1-2q\cos u+q^2}\)。
由此求 \(p_1\) 的各次谐波系数（\(p_1=c_0+\sum_{n\ge1}c_n\cos nu\)），给出 \(q\) 与 \(x_0\) 的关系。检验 \(x_0\to0\) 的线性极限。
计算 \(x_0=1\) 与 \(x_0=10\) 时 \(\abs{c_2/c_1}\)、\(\abs{c_3/c_1}\)。
强饱和时，发光图样在照明零点 \(u=\pi\) 处出现一条窄暗线。求暗线的宽度（取 \(p_1\) 降到 1/2 处的全宽，用照明周期 \(\Lambda=1/f_0\) 表示），说明它与 STED 有什么相同之处。
相位步进误差。 线性 SIM 中第二张原始像的实际相位为 \(2\pi/3+\delta\)，但重建时仍按 \(0,2\pi/3,4\pi/3\) 计算（附录 F 的分离公式）。求分离出的各分量与真值的关系，保留到 \(\delta\) 的一阶；\(\delta=10^\circ\) 时，“错误分量”混入的比例是多少？说明它在重建图像中造成什么样的伪影。
倏逝波照明能否突破 \(f_0\le2\mathrm{NA}/\lambda_{\mathrm{exc}}\)？ 样品是水溶液（\(n_{\mathrm w}=1.33\)），物镜 \(\mathrm{NA}=1.49\)（油浸，玻璃 \(n_{\mathrm g}=1.518\)），激发 488 nm，荧光 520 nm。若两束照明光在玻璃中的入射角超过全反射临界角，样品中只剩沿界面传播、垂直界面指数衰减的倏逝波，两束倏逝波干涉成条纹。求：两束光在水中传播时条纹的最高空间频率；在全反射条件下的最高空间频率；相应的 SIM 最短可恢复周期（检测截止频率按 \(2\mathrm{NA}/\lambda_{\mathrm{em}}\) 计）；倏逝波光强的穿透深度。全反射照明能否突破式 (8.4) 的 2 倍上限？
(1a) 令 \(\xi=q\ee^{\ii u}\)，\(\abs\xi<1\)。等比级数 \(\sum_{n\ge0}\xi^n=1/(1-\xi)\)，所以 \begin{align*} 1+2\sum_{n\ge1}q^n\cos nu&=2\Re\frac1{1-\xi}-1=\frac{2(1-q\cos u)}{1-2q\cos u+q^2}-1\\ &=\frac{1-q^2}{1-2q\cos u+q^2}. \end{align*} （第二步：\(\frac{1}{1-\xi}=\frac{1-\xi^*}{\abs{1-\xi}^2}\)，\(\abs{1-\xi}^2=1-2q\cos u+q^2\)。）
(1b) \(p_1=1-\dfrac{1}{1+x}=1-\dfrac{1}{\mathcal A+\mathcal B\cos u}\)，\(\mathcal A=1+x_0\)，\(\mathcal B=x_0\)。要把 \(\dfrac1{\mathcal A+\mathcal B\cos u}\) 写成 (1a) 的形式，需 \(1-2q\cos u+q^2\propto\mathcal A+\mathcal B\cos u\)，即 \((1+q^2)/(-2q)=\mathcal A/\mathcal B\)。取 \(\abs q<1\) 的根： \[q=\frac{\sqrt{\mathcal A^2-\mathcal B^2}-\mathcal A}{\mathcal B}=\frac{\sqrt{1+2x_0}-1-x_0}{x_0}<0 .\] 比较常数（在 \(u\) 的任一值处）得 \(\dfrac1{\mathcal A+\mathcal B\cos u}=\dfrac1{\sqrt{\mathcal A^2-\mathcal B^2}}\cdot\dfrac{1-q^2}{1-2q\cos u+q^2}\)，所以 \[c_0=1-\frac{1}{\sqrt{1+2x_0}},\qquad c_n=-\frac{2q^n}{\sqrt{1+2x_0}}\quad(n\ge1).\] 各次谐波按 \(\abs q^n\) 递减。线性极限：\(x_0\to0\) 时 \(\sqrt{1+2x_0}\approx1+x_0-x_0^2/2\)，\(q\approx-x_0/2\)，\(c_1\approx x_0\)，\(c_2\approx-x_0^2/2\)，即 \(p_1\approx x_0(1+\cos u)\)，与线性响应 \(p_1\approx x\) 一致。（数值 FFT 核对，偏差 \(<10^{-10}\)。）
(1c) \(\abs{c_{n+1}/c_n}=\abs q\)。\(x_0=1\)：\(q=\sqrt3-2=-0.268\)，\(\abs{c_2/c_1}=0.268\)，\(\abs{c_3/c_1}=0.072\)。\(x_0=10\)：\(q=-0.642\)，\(\abs{c_2/c_1}=0.642\)，\(\abs{c_3/c_1}=0.412\)。饱和越深，高次谐波越强，可利用的谐波越多。
(1d) 在 \(u=\pi\) 附近 \(1+\cos u\approx(u-\pi)^2/2\)，\(x\approx x_0(u-\pi)^2/2\)。\(p_1\) 在远离暗线处接近 1，在 \(x=1\) 处降到一半，即 \(\abs{u-\pi}=\sqrt{2/x_0}\)。暗线半高全宽为 \(\Delta u=2\sqrt{2/x_0}\)，换成长度是 \(\Lambda\Delta u/(2\pi)=\sqrt2\Lambda/(\pi\sqrt{x_0})\)（\(x_0=10\) 时为 \(0.142\Lambda\)，精确数值 \(0.144\Lambda\)；若改按“半深度”即 \(p_1\) 降到其最大值一半处计，精确值为 \(0.137\Lambda\)）。与 STED 相同之处：都是利用照明强度的零点附近的抛物线形状加上饱和响应，“暗区”的宽度随饱和程度按 \((\text{强度}/\text{饱和强度})^{-1/2}\) 收缩，不受衍射限制。区别只是 STED 中零点附近的分子发光，SIM 中零点附近的分子不发光。
(2) 第 \(k\) 张原始像 \(\tilde I_k=\tilde B_0+\frac\mu2\ee^{\ii\phi_k}\tilde B_++\frac\mu2\ee^{-\ii\phi_k}\tilde B_-\)，实际相位 \(\phi_k\) 只在 \(k=2\) 时比名义相位 \(\phi_k^0\) 多 \(\delta\)，其余相等。按名义相位分离：
\(\tilde B_0\) 的估计 \(\frac13\sum\tilde I_k\) 中，\(\tilde B_0\) 的系数为 1；\(\tilde B_\pm\) 的系数为 \(\frac{\mu}{6}\sum_k\ee^{\pm\ii\phi_k}=\frac\mu6\ee^{\pm\ii\phi_2^0}(\ee^{\pm\ii\delta}-1)\approx\pm\frac{\ii\mu\delta}{6}\ee^{\pm\ii\phi_2^0}\)，即混入模约为 \(\mu\delta/6\) 的调制分量（\(\delta=10^\circ\)、\(\mu=1\) 时 2.9%）。
\(\tilde B_+\) 的估计 \(\frac{2}{3\mu}\sum_k\ee^{-\ii\phi_k^0}\tilde I_k\) 中：\(\tilde B_0\) 的系数为 \(\frac{2}{3\mu}\sum\ee^{-\ii\phi_k^0}=0\)；\(\tilde B_+\) 的系数为 \(\frac13(2+\ee^{\ii\delta})\approx1+\ii\delta/3\)；\(\tilde B_-\) 的系数为 \(\frac13\sum_k\ee^{-\ii\phi_k^0}\ee^{-\ii\phi_k}=\frac13\ee^{-2\ii\phi_2^0}(\ee^{-\ii\delta}-1)\)，模为 \(\frac23\sin(\delta/2)\approx\delta/3\)。
\(\delta=10^\circ=0.175\) rad 时，“错误分量” \(\tilde B_-\) 以约 \(\delta/3=5.8\%\) 混入 \(\tilde B_+\)（数值 5.81%）。\(\tilde B_-\) 携带的是 \(\tilde C(\vect f+\vect f_0)\)，却被当作 \(\tilde C(\vect f-\vect f_0)\) 移回原位，样品频谱于是被错移了 \(2\vect f_0\)。样品中最强的成分是零频（平均亮度），它被移到 \(\pm2\vect f_0\) 处，在重建图像中表现为周期为 \(\Lambda/2\)、沿照明条纹方向的“残余条纹”伪影。另一方面，\(\tilde B_0\) 中混入的 \(\tilde B_\pm\) 在 \(\pm\vect f_0\) 处带着样品的零频成分 \(I_0\mathrm{OTF}(f_0)\tilde C(0)\)，不经搬移就留在像中，表现为周期 \(\Lambda\) 的残余照明条纹，系数 \(\mu\delta/6\)，与前一种同量级（约为其一半）。两种伪影的幅度都正比于 \(\mathrm{OTF}(f_0)\)：在不除以 OTF 的简单拼接中很弱（\(f_0=0.92f_c\) 时 \(\mathrm{OTF}=0.027\)），但实际重建要把各频带除以 OTF（去卷积或加权）以压平频谱，伪影随之被放大。所以实际 SIM 要从原始数据中精确估计每张图的实际相位。
(3) 两束平面波以 \(\pm\theta\) 入射时条纹频率 \(f_0=2n\sin\theta/\lambda_{\mathrm{exc}}\)，而 \(n\sin\theta\) 在各平行层中守恒（第 3.1 节）。
在水中传播：\(n\sin\theta=n_{\mathrm w}\sin\theta_{\mathrm w}<1.33\)，\(f_0<2\times1.33/{0.488\,}\mathrm{\mu m}={5.45\,}\mathrm{\mu m^{-1}}\)（周期 183 nm）。
全反射：光在玻璃中以 \(n_{\mathrm g}\sin\theta_{\mathrm g}\) 入射，它可以大于 \(n_{\mathrm w}\) 但不超过物镜的 \(\mathrm{NA}=1.49\)。界面上横向空间频率不变，水中的场为 \(\ee^{\ii k_xx}\ee^{-\Gamma z}\)，\(k_x=2\pi n_{\mathrm g}\sin\theta_{\mathrm g}/\lambda_{\mathrm{exc}}\)，两束干涉的条纹频率最高为 \(2\mathrm{NA}/\lambda_{\mathrm{exc}}={6.11\,}\mathrm{\mu m^{-1}}\)（周期 164 nm）。
\(f_c=2\times1.49/{0.520\,}\mathrm{\mu m}={5.73\,}\mathrm{\mu m^{-1}}\)。SIM 最短周期：传播光 \(1/(5.73+5.45)\,\mu\mathrm m={89\,}\mathrm{nm}\)，全反射 \(1/(5.73+6.11)\,\mu\mathrm m={84\,}\mathrm{nm}\)。注意：水中分子发出的、\(n\sin\theta>n_{\mathrm w}\) 的荧光（“超临界角荧光”）只来自离界面约一个波长以内的分子，所以按 \(2\mathrm{NA}/\lambda_{\mathrm{em}}\) 估算探测截止只对全反射照明的薄层合理；对传播光照明的厚样品，探测截止更接近 \(2n_{\mathrm w}/\lambda_{\mathrm{em}}\)，上面的 89 nm 偏乐观。
穿透深度：由 \(k_x^2-\Gamma^2=(2\pi n_{\mathrm w}/\lambda)^2\)，\(\Gamma=(2\pi/\lambda)\sqrt{(n_{\mathrm g}\sin\theta_{\mathrm g})^2-n_{\mathrm w}^2}\)；光强按 \(\ee^{-2\Gamma z}\) 衰减，\(1/\ee\) 深度为 \(\lambda/[4\pi\sqrt{1.49^2-1.33^2}]={58\,}\mathrm{nm}\)。
结论：全反射照明能使条纹频率达到 \(2\mathrm{NA}/\lambda_{\mathrm{exc}}\)，在样品折射率低于物镜 NA 时比传播光更细，但不能超过这一值：两束光都必须经过物镜，横向空间频率受 NA 限制，所以式 (8.4) 的 2 倍上限仍然成立。代价是只能照亮界面附近约 60 nm 的薄层。
10 实验与数据处理：标定单分子定位精度
背景。 单分子定位显微镜在使用前要标定：定位精度是否像理论预言的那样随光子数变化？点扩散函数的实际宽度 \(s\) 是多少？本题数据为模拟数据：由 scripts/exp_data.py 按下述机制逐个光子生成，随机数种子 20261017（事先固定）。
装置与数据。 把直径约 20 nm 的荧光小球稀疏地固定在盖玻片上，用油浸物镜（\(\mathrm{NA}=1.45\)）在荧光波长 \(\lambda={600\,}\mathrm{nm}\) 下成像。背景已扣除，可视为零。对 8 个小球各连续拍 \(M=200\) 帧，改变激发光强度使每个小球的每帧平均光子数 \(\bar N\) 不同。每一帧的光子落点同时按两种像素记录：相机原始像素（折算到样品面 \(a_1={100\,}\mathrm{nm}\)），以及在软件中把 \(2\times2\) 个像素合并后的大像素（\(a_2={200\,}\mathrm{nm}\)，合并后的格点与原格点对齐）。各小球相对像素格点的位置是随机的。两种记录各自用“光子记录位置的平均”（质心）定位一次。对每个小球给出 \(\bar N\) 和两种像素下 200 次定位结果在 \(x\)、\(y\) 方向的样本标准差，见表 3。
问题。
从第 7.3、7.4 节的模型出发，写出 \(\sigma^2\equiv(\sigma_x^2+\sigma_y^2)/2\) 与 \(\bar N\) 的关系，说明为什么可以合并 \(x\)、\(y\) 两个方向。已知 \(M\) 次测量的样本方差的相对标准差为 \(\sqrt{2/(M-1)}\)，估计每个 \(\sigma^2\) 的相对不确定度。
对两种像素分别作 \(\ln\sigma\)–\(\ln\bar N\) 直线拟合，求斜率及其不确定度，检验 \(\sigma\propto\bar N^{-1/2}\)。
固定斜率 \(-1/2\)，对每种像素求 \(Q\equiv\sigma^2\bar N\) 的最佳值与不确定度，并检验各点是否与常数相符。
由 \(Q\) 求 \(s\)。两种像素来自同一批光子，利用这一点设计一个不依赖 \(s\)、尽量灵敏的检验，验证像素项 \(a^2/12\)。结果说明什么？
先检验两种像素给出的 \(s\) 是否一致，再给出 \(s\) 的最佳值，与理想 Airy 斑的高斯近似 \(0.21\lambda/\mathrm{NA}\) 比较，讨论差异的可能原因。
讨论系统误差：(a) 若每个像素有平均 0.05 个背景光子，在以小球为中心的 \(7\times7\) 个原始像素内求质心，背景对 \(\sigma^2\) 有多大贡献？还有什么别的影响？(b) 光子数逐帧涨落、样品漂移、改用电子倍增 CCD 相机分别会怎样影响结果？如何从数据中检验漂移？
| \(\bar N\) | \(\sigma_x\,(a_1)\) | \(\sigma_y\,(a_1)\) | \(\sigma_x\,(a_2)\) | \(\sigma_y\,(a_2)\) |
|---|---|---|---|---|
| 121 | 9.39 | 9.02 | 10.66 | 9.33 |
| 201 | 7.27 | 6.96 | 8.17 | 7.57 |
| 348 | 6.06 | 5.41 | 6.67 | 5.88 |
| 598 | 4.17 | 4.14 | 4.73 | 4.25 |
| 998 | 3.77 | 3.24 | 4.11 | 3.69 |
| 1703 | 2.35 | 2.58 | 2.56 | 2.89 |
| 3001 | 2.09 | 1.85 | 2.26 | 1.96 |
| 4999 | 1.36 | 1.53 | 1.50 | 1.67 |
(1) 模型。 由式 (7.4)，每帧定位误差在每个方向上的方差为 \((s^2+a^2/12)/N\)。光子数 \(N\) 逐帧涨落（泊松，均值 \(\bar N\)），\(\avg{1/N}=(1/\bar N)[1+\order{1/\bar N}]\)，\(\bar N\ge120\) 时修正 \(<1\%\)，可略。所以 \[\tag{10.1} \sigma^2=\frac{Q}{\bar N},\qquad Q=s^2+\frac{a^2}{12}.\] \(x\)、\(y\) 两个方向的光子落点相互独立、模型相同（PSF 圆对称、像素是正方形），\(\sigma_x^2\)、\(\sigma_y^2\) 是同一个量的两次独立估计。两者平均后自由度为 \(2(M-1)\)，\(\sigma^2\) 的相对不确定度为 \(\sqrt{2/[2(M-1)]}=1/\sqrt{199}=7.1\%\)。由 \(\ln\sigma=\frac12\ln\sigma^2\)，\(\delta(\ln\sigma)=\frac12\delta(\ln\sigma^2)=\frac12\times7.1\%=0.035\)。
(2) 对数拟合。 令 \(X_i=\ln\bar N_i\)、\(Y_i=\ln\sigma_i\)。各点 \(Y_i\) 的不确定度相同，用不加权最小二乘（附录 G）。\(a_1\)：斜率 \(-0.492\pm0.011\)；\(a_2\)：\(-0.493\pm0.012\)（不确定度由残差估计；由 (1) 的 0.035 传递得 0.010，两者相符）。两者都与 \(-1/2\) 相差不到 \(1\sigma\)：数据支持 \(\sigma\propto\bar N^{-1/2}\)（图 16(a)）。
(3) 求 \(Q\)。 每点算 \(Q_i=\sigma_i^2\bar N_i\)（单位 \(\mathrm{nm}^2\)）：
\(a_1\)：10257，10180，11483，10324，12331，10370，11690，10474；
\(a_2\)：12141，12467，13757，12090，15224，12692，13428，12595。
各点的相对不确定度都是 7.1%，等权平均即为加权平均： \[Q_1=10889\pm291,\qquad Q_2=13049\pm373\ \ (\mathrm{nm}^2),\] 不确定度取 \(Q_i\) 的样本标准差除以 \(\sqrt8\)（按 7.1% 传递分别为 273、327，相符）。检验常数假设：\(\chi^2=\sum_i[(Q_i-\bar Q)/(0.071\bar Q)]^2\)，两组分别为 7.95、9.10，自由度 7。\(\chi^2\) 大于这两个值的概率（附录 G）分别为 34% 与 25%，可以接受。\(Q_i\) 与 \(\bar N\) 也没有系统趋势（图 16(b)）。
(4) 求 \(s\)；像素项检验。 \(\delta s=\delta Q/(2s)\)： \begin{align*} s_1&=\sqrt{Q_1-a_1^2/12}=\sqrt{10889-833}=100.3\pm1.4\ \mathrm{nm},\\ s_2&=\sqrt{13049-3333}=98.6\pm1.9\ \mathrm{nm}. \end{align*} 不依赖 \(s\) 的检验：\(Q_2-Q_1=(a_2^2-a_1^2)/12={2500\,}\mathrm{nm^2}\)。两种像素记录的是同一批光子，光子落点的高斯涨落对两者相同，在逐个小球的差 \(\Delta Q_i=Q_{2,i}-Q_{1,i}\) 中大部分相消，所以应当配对相减，而不是把 \(Q_1\)、\(Q_2\) 当作独立量相减： \begin{gather*} \Delta Q_i=1885,\ 2287,\ 2274,\ 1766,\\ 2893,\ 2322,\ 1738,\ 2121;\\ \overline{\Delta Q}=2161\pm134\ \mathrm{nm^2}. \end{gather*} （若当作独立量相减，不确定度为 \(\sqrt{291^2+373^2}=473\)。配对后误差的期望约减小一半：同一机制重复模拟 400 次，配对与不配对误差估计的中位数分别为 189 与 399，比值约 2.1；本组数据中比值达 3.5，部分是因为配对误差 134 偶然偏小，只有约 13% 的模拟会这么小。）结论有两层：
像素项确实存在：\(\overline{\Delta Q}\) 与零相差 16 倍标准差。
它的大小比预言的 2500 低 \(2.5\sigma\)。只有 8 个小球时，误差本身也是估计出来的，应按自由度 7 的 \(t\) 分布（附录 G）估计偶然出现的概率，双侧约 4%。这是一个轻微的张力：单凭这组数据不足以否定模型，也不能说“完全相符”。若按重复模拟得到的期望误差（约 200）计算，偏离约 \(1.7\sigma\)。这正说明为什么要用 \(t\) 分布：8 个点估出的误差本身就有约 25% 的不确定度。只有当它在重复实验中持续出现时，才需要怀疑像素模型。（对同一生成机制重复模拟 400 次，\(\overline{\Delta Q}\) 的平均值为 \(2494\pm10\)，说明模型本身无偏，见 VERIFY.md。）
各 \(\Delta Q_i\) 之间的散布（约 \(\pm380\)）部分来自亚像素位置效应：\(a_2={200\,}\mathrm{nm}\approx2s\) 时，单个光子的方差随小球相对像素格点的位置有约 \(\pm3\%\) 的起伏（第 7.4 节）。这一效应对随机位置平均为零，只增加散布、不造成系统偏差，而这份散布已包含在由样本标准差估计的误差 134 中。
(5) 一致性与比较。 两种像素给出的 \(s\) 相差 \(1.7\) nm，按独立误差计算为 \(0.7\sigma\)；由于来自同一批光子，两者高度相关，逐个小球配对比较给出 \(s_2-s_1=-1.8\pm0.7\) nm，与 (4) 中 \(\overline{\Delta Q}\) 略低于预言是同一件事（\(2.6\sigma\)）。这个差（1.8 nm）远小于 \(s\) 与理想值之差（约 12 nm），合并不影响下面的结论：对每个小球取两种像素的 \(s\) 的平均，再对 8 个小球求平均，并把半差 0.9 nm 作为系统误差，得 \[s=99.3\pm1.6\,(\text{统计})\pm0.9\,(\text{系统})\ \mathrm{nm}\approx99.3\pm1.8\ \mathrm{nm}.\] 理想值 \(0.21\lambda/\mathrm{NA}=0.21\times600/1.45={87\,}\mathrm{nm}\)。测得 \(s\) 大 14%，偏离约 \(7\sigma\)，差异显著。可能的原因：离焦（小球不在焦面上，PSF 变宽）；油的折射率与样品介质不匹配造成的球差；高 NA 下的矢量衍射效应；荧光光谱有一定宽度（长波成分的 PSF 更宽）。小球本身的大小（半径 10 nm，投影方差约 \(R^2/5={20\,}\mathrm{nm^2}\)）只使 \(s^2\) 增加 0.2%，可以忽略。注意：本题是模拟数据，生成时把 \(s\) 设为 98 nm，用来代表这些因素的总效果；单凭这组数据无法区分是哪一种原因，要区分需要改变离焦量、换浸油等对照实验。
(6) 系统误差。
(a) 背景：区域内背景光子平均数 \(n_{\mathrm b}=0.05\times49=2.45\)，质心为 \(\hat x=(\sum_{\text{信号}}x+\sum_{\text{背景}}x_p)/(N+n_{\mathrm b})\)，\(x_p\) 从小球位置（区域中心）量起。背景有两个作用：分子上多出方差 \(b^2\sum_px_p^2\)；分母变大，使信号涨落按 \(N/(N+n_{\mathrm b})\) 被压缩（第 7.4 节）。合起来 \[\sigma^2\approx\frac{NQ+b^2\sum_px_p^2}{(N+n_{\mathrm b})^2}.\] \(7\times7\) 个 100 nm 像素，\(\sum_px_p^2=7\times2\times(100^2+200^2+300^2)\ \mathrm{nm^2}={1.96\times 10^{6}\,}\mathrm{nm^2}\)，\(b^2=0.05\)。\(\bar N=120\) 时 \(\sigma^2={90.1\,}\mathrm{nm^2}\)，比无背景时的 87.0 nm2 大 3.6%（若只计分子上的背景项会误得 7.8%，因为忽略了分母对信号涨落的压缩）；\(\bar N=1000\) 时只大 0.4%。光子级蒙特卡罗给出 \(+3.7\%\) 与 \(+0.5\%\)（统计误差约 1%，scripts/exp_data.py）。所以背景会使小 \(\bar N\) 端的 \(Q_i\) 上翘约 3–4%，约为单点统计误差（7%）的一半。此外背景把质心拉向区域中心，\(\bar N=120\) 时约 2%，是系统偏差。实际做法是缩小求质心的区域，或用包含背景项的模型拟合。本题已假设背景扣除为零。
(b) 光子数涨落：使 \(\sigma^2\) 偏大约 \(1/\bar N\)，在 \(\bar N=120\) 时为 0.8%，远小于 7% 的统计误差。
漂移：样品在 200 帧内的机械漂移给每个小球的定位加上一个与 \(\bar N\) 无关的方差 \(\sigma_{\mathrm d}^2\)，模型变为 \(\sigma^2=Q/\bar N+\sigma_{\mathrm d}^2\)，在大 \(\bar N\) 端表现为 \(Q_i\) 上翘。检验方法：以 \(1/\bar N\) 为自变量，对 \(\sigma^2\) 作带截距的加权直线拟合（附录 G）。两种像素的截距分别为 \(0.03\pm0.17\)、\(-0.01\pm0.20\ \mathrm{nm^2}\)，都与零相符，漂移可以忽略。
电子倍增 CCD：倍增过程的随机性使信号的涨落增大，有效方差约加倍[33]（过量噪声因子 \(F^2\approx2\)），即 \(Q\to2Q\)。若不知道这一点而直接用式 (10.1)，会得到 \(s=\sqrt{2Q_1-833}\approx{145\,}\mathrm{nm}\)，严重偏大。
11 小结：推导链
波与空间频率：平面波 \(\Leftrightarrow\) 横向空间频率 \(n\sin\theta/\lambda\)；惠更斯–菲涅耳原理 + 远场近似 \(\Rightarrow\) 衍射振幅 = 孔径函数的傅里叶变换（式 (3.5)）\(\Rightarrow\) 单缝、光栅方程 (3.10)、Airy 斑 (3.11)。
阿贝：物 = 光栅的叠加；成像需要至少两个衍射级进入物镜 \(\Rightarrow\) \(d_{\min}=\lambda/\mathrm{NA}\)（正入射）、\(\lambda/(2\mathrm{NA})\)（斜照明）。傅里叶光学：相干成像 = 乘以光瞳函数（截止 \(\mathrm{NA}/\lambda\)）；荧光是非相干成像，强度卷积 \(\Rightarrow\) OTF = 光瞳自相关，截止 \(f_c=2\mathrm{NA}/\lambda\)（式 (4.8)）；PSF 宽度 \(0.51\lambda/\mathrm{NA}\)，瑞利距离 \(0.61\lambda/\mathrm{NA}\)。
衍射极限：线性成像中 \(\abs{\vect f}>f_c\) 的信息为零，与光强和算法无关；出路是打破“线性”“无先验”“均匀照明”之一。
荧光动力学：速率方程 (5.3) \(\Rightarrow\) 激发饱和 \(I_{\mathrm{sat}}=h\nu/(\sigma_{\mathrm a}\tau)\)；受激辐射耗尽 \(\eta=\ee^{-I/I_s}\)（脉冲，\(I_s=h\nu/\sigma_{\mathrm{se}}\tau_p\)）或 \(1/(1+I/I_s)\)（连续，\(I_s=h\nu/\sigma_{\mathrm{se}}\tau\)）。
STED：涡旋相位 \(\Rightarrow\) 中心零点、\(I\approx I_{\max}(r/r_0)^2\)；有效 PSF = 激发 PSF × \(\eta\) \(\Rightarrow\) \(w=w_0/\sqrt{1+\beta\zeta}\)（式 (6.3)）；功率、零点质量与漂白决定实际极限。
单分子定位：独立光子的平均值 \(\Rightarrow\) \(\sigma_{\mathrm{loc}}^2=(s^2+a^2/12)/N\)（+ 背景项）；重建图像还受奈奎斯特标记密度限制；MINFLUX 用零点把有效宽度从 \(s\) 换成 \(L/4\)。
SIM：积化和差 / 调制定理 \(\Rightarrow\) 频谱搬移 \(\pm\vect f_0\)；三相位 × 三方向分离与拼接 \(\Rightarrow\) 线性上限 \(f_c+f_0\approx2f_c\)；饱和产生谐波 \(\Rightarrow\) 非线性 SIM 原则上无上限。
参考文献
附录 A 圆孔衍射与 Airy 斑
贝塞尔函数
本讲用到两个函数，用积分定义： \begin{gather*} J_0(x)=\frac1{2\pi}\int_0^{2\pi}\ee^{\ii x\cos\varphi}\dd\varphi,\tag{A.1}\\ J_1(x)=\frac{1}{2\pi\ii}\int_0^{2\pi}\ee^{\ii\varphi}\,\ee^{\ii x\cos\varphi}\dd\varphi . \end{gather*} 一般地， \[J_n(x)=\frac{1}{2\pi\ii^n}\int_0^{2\pi}\ee^{\ii n\varphi}\ee^{\ii x\cos\varphi}\dd\varphi .\] 把 \(\ee^{\ii x\cos\varphi}\) 展开成幂级数并逐项积分，利用 \(\frac1{2\pi}\int_0^{2\pi}\cos^{2k}\varphi\,\dd\varphi=\frac{(2k)!}{2^{2k}(k!)^2}\)（奇次幂积分为零），得 \begin{gather*} J_0(x)=\sum_{k=0}^\infty\frac{(-1)^k}{(k!)^2}\Big(\frac x2\Big)^{2k},\\ J_1(x)=\sum_{k=0}^\infty\frac{(-1)^k}{k!(k+1)!}\Big(\frac x2\Big)^{2k+1} \end{gather*} （\(J_1\) 的级数同理，用 \(\frac1{2\pi}\int\cos\varphi\cos^{2k+1}\varphi\,\dd\varphi\)）。逐项求导可验证 \[\tag{A.2} \dv{}{x}\big[xJ_1(x)\big]=xJ_0(x).\] 小 \(x\) 时 \(J_0\approx1-x^2/4\)，\(J_1\approx x/2\)；大 \(x\) 时它们像振幅按 \(x^{-1/2}\) 衰减的余弦。\(J_1\) 的前三个正零点为 3.8317、7.0156、10.1735（scripts/verify_numeric.py 用 scipy 核对，并与式 (A.1) 的数值积分比较）。
圆孔的远场
直径 \(D\) 的圆孔，用极坐标 \((\rho',\varphi')\) 表示孔内一点，观察方向的空间频率 \(\vect f\) 的大小为 \(f=\sin\theta/\lambda\)（空气中），方位角为 \(\psi\)。式 (3.5) 的积分为 \begin{align*} \tilde U(f)&=\int_0^{D/2}\rho'\dd\rho'\int_0^{2\pi}\ee^{-\ii2\pi f\rho'\cos(\varphi'-\psi)}\dd\varphi'\\ &=2\pi\int_0^{D/2}J_0(2\pi f\rho')\,\rho'\dd\rho' . \end{align*} （内层积分把 \(\varphi'-\psi\) 换成积分变量，并注意 \(J_0\) 是偶函数。）令 \(x=2\pi f\rho'\)，用式 (A.2)： \begin{align*} \tilde U(f)&=\frac{2\pi}{(2\pi f)^2}\int_0^{\pi fD}xJ_0(x)\dd x=\frac{2\pi}{(2\pi f)^2}\,\pi fD\,J_1(\pi fD)\\ &=\frac{\pi D^2}{4}\cdot\frac{2J_1(v)}{v},\qquad v=\pi fD=\frac{\pi D\sin\theta}{\lambda}. \end{align*} \(\pi D^2/4\) 是孔的面积，即 \(\theta=0\) 时的振幅。取模平方即得式 (3.11)。
显微镜的点扩散函数
式 (4.4) 中的 \(h\) 是半径 \(\mathrm{NA}/\lambda\) 的圆盘（光瞳）的逆变换，计算完全相同，只是把“孔半径 \(D/2\)”换成“频率半径 \(\mathrm{NA}/\lambda\)”、把“频率 \(f\)”换成“位置 \(r\)”：\(h(r)\propto2J_1(v)/v\)，\(v=2\pi\mathrm{NA}\,r/\lambda\)，即式 (4.5)。
几个数值
强度 \([2J_1(v)/v]^2\) 降到一半处 \(v=1.6163\)，第一零点 \(v=3.8317\)，与艾里 1835 年的表（1.616 与 3.832）一致[3]；第一暗环以内的能量占 83.8%（scripts/verify_numeric.py 数值积分核对）。
附录 B 非相干光学传递函数
由第 4.4 节，\(\tilde H(\vect f)\) 等于两个半径 \(f_{\mathrm p}=\mathrm{NA}/\lambda\)（光瞳的频率半径）、圆心相距 \(f=\abs{\vect f}\) 的圆盘的重叠面积。重叠区被两圆的公共弦分成两个相同的弓形。设 \(q=f/(2f_{\mathrm p})\)，弦到每个圆心的距离为 \(f/2=qf_{\mathrm p}\)，弦所对圆心角为 \(2\chi\)，\(\cos\chi=q\)。一个弓形的面积 = 扇形面积 − 三角形面积 \(=f_{\mathrm p}^2\chi-f_{\mathrm p}^2\sin\chi\cos\chi\)。重叠面积 \[S_{\mathrm o}(f)=2f_{\mathrm p}^2\big(\chi-\sin\chi\cos\chi\big)=2f_{\mathrm p}^2\big(\arccos q-q\sqrt{1-q^2}\big).\] 除以 \(f=0\) 时的面积 \(\pi f_{\mathrm p}^2\)，并注意 \(q=f/(2f_{\mathrm p})=f/f_c\)，即得式 (4.9)。检验：\(f=0\) 时为 1；\(f=f_c\) 时为 0；\(f=f_c/2\) 时为 0.391。scripts/fig_transfer.py 用二维离散自相关逐点核对（偏差 \(<0.01\)）。
附录 C 涡旋光瞳的焦斑
光瞳用归一化半径 \(\rho=\abs{\vect f}/(\mathrm{NA}/\lambda)\in[0,1]\) 与方位角 \(\varphi\) 表示，焦面上一点用 \(v=2\pi\mathrm{NA}\,r/\lambda\) 与方位角 \(\psi\) 表示，则 \(2\pi\vect f\cdot\vect r=v\rho\cos(\varphi-\psi)\)。加涡旋相位后 \begin{align*} h_{\mathrm v}&\propto\int_0^1\rho\dd\rho\int_0^{2\pi}\ee^{\ii\varphi}\ee^{\ii v\rho\cos(\varphi-\psi)}\dd\varphi\\ &=2\pi\ii\,\ee^{\ii\psi}\int_0^1J_1(v\rho)\,\rho\dd\rho\equiv2\pi\ii\,\ee^{\ii\psi}g_{\mathrm v}(v). \end{align*} 第二步令 \(\varphi'=\varphi-\psi\) 并用式 (A.1) 中 \(J_1\) 的定义。强度 \(\propto g_{\mathrm v}(v)^2\)，与方位角无关（圆环）。
中心附近：\(J_1(x)\approx x/2\)，\(g_{\mathrm v}(v)\approx\frac v2\int_0^1\rho^2\dd\rho=v/6\)，强度 \(\propto v^2/36\)，与第 6.2 节的展开一致。
峰值：数值求 \(g_{\mathrm v}^2\) 的极大，在 \(v=2.4516\)（\(r=0.390\lambda/\mathrm{NA}\)），\(g_{\max}^2=0.06469\)。于是 \(I/I_{\max}\approx(v/6)^2/0.06469=0.4294v^2\)，即式 (6.1)：\(r_0=\lambda/(2\pi\sqrt{0.4294}\,\mathrm{NA})=0.243\lambda/\mathrm{NA}\)。
与普通聚焦光斑比较：无涡旋时中心振幅为 \(2\pi\int_0^1J_0(0)\rho\dd\rho=\pi\)，此处峰值振幅为 \(2\pi g_{\max}\)，强度比 \(4g_{\max}^2=0.259\)。
总功率：相位板不改变光瞳上的光强，焦面上的总功率不变。对普通光斑积分式 (4.10)（利用 \(\int_0^\infty J_1^2(v)\dd v/v=1/2\)）， \[\int H\dd A=4\pi\Big(\frac{\lambda}{2\pi\mathrm{NA}}\Big)^2H(0).\] 同一功率的环形光峰值 \(I_{\max}=0.259H(0)\)，所以 \[\int I\dd A=\frac{4\pi}{0.259}\Big(\frac{\lambda}{2\pi\mathrm{NA}}\Big)^2I_{\max}=1.23\,I_{\max}\Big(\frac{\lambda}{\mathrm{NA}}\Big)^2,\] 即例题 2 所用的关系。
\(g_{\mathrm v}(v)\) 也可写成闭式 \(g_{\mathrm v}(v)=\frac{\pi}{2v}[J_1(v)\mathbf H_0(v)-J_0(v)\mathbf H_1(v)]\)（\(\mathbf H_n\) 为 Struve 函数），scripts/optics.py 用它作图，并与二维 FFT 及直接数值积分核对（最大偏差 \(<0.01\)）。
附录 D 概率与统计工具
样本方差的涨落
对 \(M\) 个独立的高斯变量（期望 \(x_0\)、方差 \(\sigma^2\)），样本方差 \(\hat\sigma^2=\frac1{M-1}\sum(x_j-\bar x)^2\) 的期望为 \(\sigma^2\)。它的涨落可以这样估计：\(M\) 很大时 \(\bar x\approx x_0\)，\(\hat\sigma^2\approx\frac1M\sum y_j\)，\(y_j=(x_j-x_0)^2\)。\(y_j\) 相互独立，\(\avg{y_j}=\sigma^2\)，\(\avg{y_j^2}=\avg{(x-x_0)^4}=3\sigma^4\)（高斯分布的四阶矩，由 \(\int t^4\ee^{-t^2/2}\dd t=3\sqrt{2\pi}\) 得到），所以 \(\operatorname{Var}y_j=2\sigma^4\)，\(\operatorname{Var}\hat\sigma^2\approx2\sigma^4/M\)。把用 \(\bar x\) 代替 \(x_0\) 所损失的一个自由度计入，\(M\to M-1\)，相对标准差为 \(\sqrt{2/(M-1)}\)（scripts/verify_numeric.py 用蒙特卡罗核对）。由 \(\delta\hat\sigma/\hat\sigma=\frac12\delta\hat\sigma^2/\hat\sigma^2\)，样本标准差的相对标准差约为 \(1/\sqrt{2(M-1)}\)。
定位精度的理论下限（选读）
统计学中的“克拉默–拉奥下限”说：若每个光子的落点概率密度为 \(\varrho(x-x_0)\)，则由 \(N\) 个独立光子对 \(x_0\) 作任何无偏估计，方差不小于 \(1/(N\mathcal F)\)，其中 \(\mathcal F=\int(\partial_x\varrho)^2/\varrho\,\dd A\) 称为（单光子的）费希尔信息。对高斯 PSF，\(\mathcal F=1/s^2\)，下限就是 \(s^2/N\)，质心法已经达到。对 Airy 斑，\(\varrho\propto h^2\)（\(h\) 为实的振幅 PSF），\((\partial_x\varrho)^2/\varrho=4(\partial_xh)^2\)，由帕塞瓦尔定理（函数平方的积分等于其傅里叶变换模平方的积分）与“求导对应乘以 \(\ii2\pi f_x\)”， \begin{align*} \mathcal F&=\frac{4\int(\partial_xh)^2\dd A}{\int h^2\dd A}=\frac{4\int(2\pi f_x)^2\abs P^2\dd^2f}{\int\abs P^2\dd^2f}\\ &=16\pi^2\avg{f_x^2}_{\text{光瞳}}=4\pi^2\Big(\frac{\mathrm{NA}}{\lambda}\Big)^2, \end{align*} 最后一步用了均匀圆盘上 \(\avg{f_x^2}=f_{\mathrm p}^2/4\)，\(f_{\mathrm p}=\mathrm{NA}/\lambda\)。于是 \(\sigma_{\min}=\lambda/(2\pi\mathrm{NA}\sqrt N)\)，与 Ober 等人的结果一致[31]，比高斯近似的 \(0.21\lambda/(\mathrm{NA}\sqrt N)\) 小约 25%。scripts/verify_numeric.py 用数值积分核对了 \(\mathcal F=4\pi^2(\mathrm{NA}/\lambda)^2\)。
附录 E 采样定理与混叠
在间隔为 \(\Delta\) 的点 \(x_j=j\Delta\) 上对余弦 \(\cos(2\pi fx)\) 采样。由于 \(2\pi(1/\Delta)x_j=2\pi j\)， \[\cos(2\pi fx_j)=\cos\big(2\pi j-2\pi fx_j\big)=\cos\Big[2\pi\Big(\frac1\Delta-f\Big)x_j\Big],\] 频率 \(f\) 与 \(1/\Delta-f\) 在所有样点上取值完全相同，无法区分（混叠）。若已知函数只含 \(0\le f\le f_{\max}\) 的成分，为使任何两个允许的频率都不混叠，需 \(1/\Delta-f_{\max}\ge f_{\max}\)，即 \[\Delta\le\frac{1}{2f_{\max}}\qquad(\text{奈奎斯特判据}).\] 可以进一步证明，满足这一条件时用适当的插值公式能由样点唯一复原原函数（香农采样定理），此处不展开。单分子定位中“样点”是随机分布的标记分子，判据只作数量级估计用[34]。
附录 F SIM 的三相位分离与饱和谐波
分离
记 \(\omega=\ee^{\ii2\pi/3}\)，\(\phi_k=2\pi(k-1)/3\)。三个方程 \(\tilde I_k=\tilde B_0+\frac\mu2\omega^{k-1}\tilde B_++\frac\mu2\omega^{-(k-1)}\tilde B_-\)。利用 \(1+\omega+\omega^2=0\)： \begin{gather*} \frac13\sum_k\tilde I_k=\tilde B_0,\\ \frac{2}{3\mu}\sum_k\omega^{-(k-1)}\tilde I_k=\tilde B_+,\qquad \frac{2}{3\mu}\sum_k\omega^{k-1}\tilde I_k=\tilde B_-. \end{gather*} （例如第二式中 \(\tilde B_0\) 的系数为 \(\frac{2}{3\mu}\sum\omega^{-(k-1)}=0\)，\(\tilde B_+\) 的系数为 \(\frac{2}{3\mu}\cdot\frac\mu2\cdot3=1\)，\(\tilde B_-\) 的系数为 \(\frac{2}{3\mu}\cdot\frac\mu2\sum\omega^{-2(k-1)}=0\)。）系数矩阵行列式的模为 \(3\sqrt3\mu^2/4\)。
演示中的简单重建
在空间域，相位为 \(\phi\) 的原始像为 \(I_\phi=H\otimes\{C[1+\cos(2\pi\vect f_0\cdot\vect r+\phi)]\}\)（取 \(\mu=1\)，略去常数 \(I_0\)）。按上式分离出三幅“频带像” \(B_0=H\otimes C\)、\(B_\pm=H\otimes(C\ee^{\pm\ii2\pi\vect f_0\cdot\vect r})\)，再乘以 \(\ee^{\mp\ii2\pi\vect f_0\cdot\vect r}\) 把频谱移回原位，相加得重建像 \(I_{\mathrm{rec}}=B_0+B_+\ee^{-\ii2\pi\vect f_0\cdot\vect r}+B_-\ee^{\ii2\pi\vect f_0\cdot\vect r}\)。对样品 \(C=1+\cos(2\pi\vect f_s\cdot\vect r)\) 逐项计算（每个频率分量乘以该频率处的 OTF）， \begin{align*} I_{\mathrm{rec}}={}&1+2\,\mathrm{OTF}(f_0)+\big[\mathrm{OTF}(\abs{\vect f_s})\\ &+\mathrm{OTF}(\abs{\vect f_s-\vect f_0})+\mathrm{OTF}(\abs{\vect f_s+\vect f_0})\big]\\ &\times\cos(2\pi\vect f_s\cdot\vect r). \end{align*} 只要三个 OTF 中有一个不为零，样品条纹就被恢复。演示 superres-sim 显示的是这个结果（未作任何去卷积与加权，实用的算法会对各频带除以 OTF 并加权以压平频谱）。
饱和谐波的精确系数
修正贝塞尔函数可以由生成函数定义（与式 (A.1) 类比）： \[\ee^{z\cos u}=\sum_{n=-\infty}^{\infty}I_n(z)\,\ee^{\ii nu},\qquad I_n(z)=\frac1{2\pi}\int_0^{2\pi}\ee^{z\cos u}\cos nu\,\dd u .\] 由式 (8.5)，把 \(z=-\kappa/2\) 代入并用 \(I_n(-z)=(-1)^nI_n(z)\)： \[p_1=1-\ee^{-\kappa(1+\cos u)/2}=1-\ee^{-\kappa/2}\sum_n(-1)^nI_n(\kappa/2)\,\ee^{\ii nu}.\] 所以 \(\ee^{\ii nu}\)（\(n\ne0\)）的系数为 \(e_n=-(-1)^n\ee^{-\kappa/2}I_n(\kappa/2)\)，\(\cos nu\) 的系数为 \(2e_n\)。小 \(\kappa\) 时 \(I_n(z)\approx(z/2)^n/n!\)，与第 8.3 节的二阶展开一致。图 15(c) 画出 \(\abs{e_n}\)，并用数值 FFT 核对（偏差 \(<10^{-10}\)）。
附录 G 最小二乘拟合公式
直线 \(y=y_0+Kx\)，各点等权
记 \(\bar x=\frac1n\sum x_i\)，\(\bar y\) 同理，\(S_{xx}=\sum(x_i-\bar x)^2\)。使 \(\sum(y_i-y_0-Kx_i)^2\) 最小（对 \(y_0\)、\(K\) 求偏导令其为零），得 \[K=\frac{\sum(x_i-\bar x)(y_i-\bar y)}{S_{xx}},\qquad y_0=\bar y-K\bar x .\] 若各点 \(y_i\) 的标准差同为 \(\sigma_y\)，\(K\) 是 \(y_i\) 的线性组合，由方差相加 \(\sigma_K=\sigma_y/\sqrt{S_{xx}}\)。\(\sigma_y\) 未知时用残差估计 \(\sigma_y^2\approx\sum(y_i-y_0-Kx_i)^2/(n-2)\)（减 2 是因为两个参数已由数据定出）。
加权
各点标准差 \(\sigma_i\) 不同时，最小化 \(\chi^2=\sum[(y_i-y_0-Kx_i)/\sigma_i]^2\)。记 \(w_i=1/\sigma_i^2\)，\(W=\sum w_i\)，\(W_x=\sum w_ix_i\)，\(W_y=\sum w_iy_i\)，\(W_{xx}=\sum w_ix_i^2\)，\(W_{xy}=\sum w_ix_iy_i\)，\(\Delta=WW_{xx}-W_x^2\)： \begin{gather*} K=\frac{WW_{xy}-W_xW_y}{\Delta},\qquad y_0=\frac{W_{xx}W_y-W_xW_{xy}}{\Delta},\\ \sigma_K=\sqrt{\frac{W}{\Delta}},\qquad \sigma_{y_0}=\sqrt{\frac{W_{xx}}{\Delta}} . \end{gather*} 只拟合一个常数 \(y=\bar Q\) 时，\(\bar Q=\sum w_iy_i/\sum w_i\)，\(\sigma_{\bar Q}=(\sum w_i)^{-1/2}\)；各点相对误差相同、数值又相近时，退化为普通平均。
\(\chi^2\) 检验与 \(p\) 值
若模型正确、各 \(\sigma_i\) 估计正确，每一项 \((y_i-\text{模型})/\sigma_i\) 是一个期望为 0、方差为 1 的高斯变量，它们的平方和 \(\chi^2\) 的期望等于自由度 \(\nu\)（数据点数减去拟合参数个数），标准差约为 \(\sqrt{2\nu}\)。\(\chi^2\) 明显大于 \(\nu\)（例如超过 \(\nu+2\sqrt{2\nu}\)）说明模型或误差估计有问题。更精确地，“模型正确时 \(\chi^2\) 偶然大于测得值的概率”称为 \(p\) 值，可由 \(\chi^2\) 分布表查得（或用 scipy.stats.chi2.sf 计算），\(p\) 只有百分之几或更小时才认为不相符。比较一个平均值与预言值时，若误差本身是由少数几个点的散布估计的（\(n\) 个点），偏离倍数 \(t=(\text{测量}-\text{预言})/\text{标准误}\) 服从自由度 \(n-1\) 的 \(t\) 分布，它比高斯分布“尾巴”更长；\(n=8\) 时 \(\abs t>2.5\) 的概率约 4%，而高斯分布为 1.2%。